New England Biolabs, E7125S, módulo de conversión enzimática de metil-seq NEBNext®

Categorías relacionadas con NEBNext Conversión enzimática para análisis de metilación de ADN, Automatización para preparación de bibliotecas NGS NEBNext®, Análisis de metilación de ADN, Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Tubos de tiras de PCR Formamida (Sigma n.º F9037-100 ml) o NaOH 0,1 N Etanol al 80 % 0,1 X TE, pH 8,0 Perlas de limpieza con agua sin nucleasas: Perlas de purificación de muestras NEBNext (suministradas con el kit de metil-seq enzimático, NEB n.º E7120), kit de reactivos SPRIselect® (Beckman Coulter, Inc. n.º B23317), perlas AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. n.º A63881) o el fabricante de perlas preferido. Gradilla/soporte magnético, como la gradilla de separación magnética NEBNext (NEB n.º S1515), la máquina PCR Bioanalyzer®, TapeStation® y consumibles asociados u otro analizador de fragmentos. Preguntas frecuentes : P: ¿Qué tipos de muestras se pueden procesar con el kit NEBNext® Enzymatic Methyl-seq y el módulo de conversión Enzymatic Methyl-seq? R: NEBNext Enzymatic Methyl-seq se puede utilizar con ADN genómico, ADN libre de células y ADN FFPE. P: ¿Cuáles son las entradas recomendadas para el kit NEBNext® Enzymatic Methyl-seq y el módulo de conversión Enzymatic Methyl-seq? R: El protocolo se ha optimizado para entradas que oscilan entre 10 y 200 ng. También hay disponible un protocolo modificado para entradas de hasta 500 ng. P: ¿Cuál es la diferencia entre el kit NEBNext Enzymatic Methyl-seq y el módulo de conversión Enzymatic Methyl-seq? R: El kit de metil-seq enzimático NEBNext contiene todos los componentes necesarios para crear una biblioteca de EM-seq, incluyendo reactivos para la oxidación de 5-mC/5-hmC y la desaminación de citosina, reactivos para la construcción de bibliotecas y el adaptador de EM-seq, así como la mezcla maestra NEBNext Q5U y cebadores únicos dobles para la amplificación de bibliotecas. El módulo de conversión de metil-seq enzimático no contiene reactivos para la construcción y amplificación de bibliotecas, ni adaptadores ni cebadores. P: ¿Qué tampones se recomiendan para el cizallamiento de ADN en los flujos de trabajo de metil-seq enzimático (EM-seq™) de NEB? R: Para usar con el kit NEBNext® Enzymatic Methyl-seq (NEB #E7120), el ADN debe cizallarse en uno de los siguientes tampones: Tris-HCl 10 mM pH 7,5 o pH 8,0, TE 1X (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM) o TE bajo (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM). No recomendamos cizallar el ADN de entrada en TE 0,1X (Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM) ni en agua. Para usar con el módulo de conversión NEBNext® Enzymatic Methyl-seq (NEB #E7125), el ADN no debe estar en un tampón que contenga EDTA antes de proceder con la reacción de oxidación. Por lo tanto, se recomienda cizallar el ADN en Tris 10 mM pH 8,0. Alternativamente, si se realiza el cizallamiento en 1X TE o TE bajo, se requiere una limpieza de columna o microesferas seguida de una elución en Tris-HCl 10 mM pH 8,0 o agua libre de nucleasas. P: ¿Puede almacenarse el tampón TET2 "activo" durante más de 4 meses? R: No. El tampón TET2 "activo" debe desecharse después de 4 meses. P: ¿Puede almacenarse a largo plazo la solución de Fe(II) recién diluida? R: No. La solución de hierro recién diluida debe desecharse inmediatamente después de su uso. P: ¿Por qué, en algunas etapas del protocolo EM-seq, las perlas de purificación de muestras NEBNext se comportan de forma diferente al limpiar la muestra? R: El comportamiento de las perlas cambia dependiendo de la limpieza y del paso de reacción EM-seq anterior. Se debe tener especial cuidado después de la desaminación de APOBEC, ya que las perlas tienden a aglutinarse con mayor facilidad. No seque demasiado las microesferas antes de la elución del ADN en este paso, ya que esto puede dificultar la resuspensión de las microesferas y reducir la recuperación de ADN. P: ¿Se puede utilizar ADN fragmentado enzimáticamente como material de entrada para EM-seq™? R: NEBNext UltraShear™ es el único reactivo de fragmentación enzimática que recomendamos antes del flujo de trabajo de EM-Seq. No recomendamos otros métodos de fragmentación basados ​​en enzimas, ya que pueden afectar las marcas de metilación del ADN. Para usar EM-seq™ con NEBNext UltraShear™, siga el protocolo de la «Sección 3» del manual enlazado a continuación. Español: https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manualm7634.pdf?rev=64e0e81d781748dba43702e4a78da971&hash=09F5E6499849C9045DFAE1A3AB3BDAA9 P: ¿Puedo usar NaOH (hidróxido de sodio) en lugar de formamida para desnaturalizar mi ADN antes de la reacción de desaminación? R: Sí, es posible usar NaOH, aunque se recomienda la formamida, ya que es más fácil de manipular. Si se usa NaOH, es fundamental que la concentración de la solución de NaOH sea precisa y que el volumen añadido a la reacción sea exactamente de 4 μl. El NaOH es altamente corrosivo. Se deben seguir las pautas de seguridad locales e institucionales al trabajar con NaOH. Si está haciendo una dilución de NaOH 2 N, asegúrese de que la solución madre tenga al menos un pH de 12,5. Verifique el pH de la solución madre antes de usarla. Evite diluciones inexactas preparando un volumen suficientemente grande de NaOH diluido para minimizar los errores de pipeteo. Recomendamos preparar al menos 1 ml. Prepare diluciones de NaOH frescas o guarde alícuotas diluidas a -20 °C hasta por 6 meses para evitar un cambio en la concentración. El NaOH sólido es delicuescente (absorbe agua de la atmósfera). No se puede pesar con precisión. Por lo tanto, las soluciones preparadas a partir de pellets de NaOH deben titularse para lograr la concentración adecuada. P: ¿Es normal que la solución de Fe(II) del producto EM-seq sea amarilla o se observe un cambio de color? R: Sí, se ha observado una variación de color (de incoloro a amarillo). Las pruebas no han demostrado ninguna diferencia en el rendimiento en función de esta variación. P: ¿Puedo usar NaOH (hidróxido de sodio) en lugar de formamida para desnaturalizar mi ADN antes de la reacción de desaminación? R: ¿Puedo usar NaOH (hidróxido de sodio) en lugar de formamida para desnaturalizar mi ADN antes de la reacción de desaminación? Sí, es posible usar NaOH, aunque se recomienda la formamida, ya que es más fácil de manejar. Si se usa NaOH, la concentración de la solución de NaOH debe ser precisa y el volumen agregado a la reacción es exactamente 4 μl. El NaOH es altamente corrosivo. Se deben seguir las pautas de seguridad locales e institucionales al trabajar con NaOH. Si está haciendo una dilución de NaOH 2 N, asegúrese de que la solución madre tenga al menos un pH de 12,5. Verifique el pH de la solución madre antes de usar. Evite diluciones inexactas haciendo un volumen suficientemente grande de NaOH diluido para minimizar los errores de pipeteo. Recomendamos hacer al menos 1 ml. Prepare diluciones de NaOH frescas o almacene alícuotas diluidas a -20 °C hasta por 6 meses para evitar un cambio en la concentración. El NaOH sólido es delicuescente (absorbe agua de la atmósfera). No se puede pesar con precisión. Por lo tanto, las soluciones preparadas a partir de pellets de NaOH deben titularse para lograr la concentración adecuada. P: ¿Es normal que la solución de Fe(II) del producto EM-seq™ sea amarilla o se observe un cambio de color? R: Sí, se ha observado variación de color (de incolora a amarilla). Las pruebas no han demostrado ninguna diferencia en el rendimiento debido a esta variación.