New England Biolabs, E7360L, módulo de reparación de ADN FFPE NEBNext v2

Este nuevo producto mejora aún más la reparación del ADN FFPE en los flujos de trabajo de secuenciación de próxima generación (NGS). Categorías relacionadas ADN FFPE,, Especificaciones de preparación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación Materiales necesarios pero no suministrados Kit de preparación de biblioteca de ADN NEBNext Ultra II (NEB n.º E7645S, n.º E7645L, n.º E7103S o n.º E7103L) para Illumina u otros Agua libre de nucleasas con 80 % de etanol 0,1 X TE (1 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) Tubos de tiras para PCR libres de ADNasa y ARNasa Tubos DNA LoBind® (Eppendorf n.º 022431021) Kit de reactivos SPRIselect® (Beckman Coulter, Inc. n.º B23317) o perlas AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. n.º A63881) Oligos multiplex NEBNext para Illumina (www.neb.com/oligos) Soporte/gradilla magnética (NEB #S1515, Alpaqua® cat. #A001322 o equivalente) Termociclador Agilent Bioanalyzer® o TapeStation® y reactivos y consumibles asociados Adaptador de tampón de dilución NEB #B1430S o NEBNext Unique Dual Index UMI Adaptador de tampón de dilución suministrado con NEB #E7395S/L Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre el módulo NEBNext FFPE DNA Repair v2 (NEB #E7360) y la mezcla de reparación de ADN NEBNext FFPE (NEB #M6630)? R: El módulo NEBNext FFPE DNA Repair v2 contiene las mismas actividades de reparación que la mezcla de reparación de ADN NEBNext FFPE, pero se ha optimizado para una mayor eficiencia de reparación, un flujo de trabajo más ágil con la preparación de bibliotecas NEBNext y un tampón de reacción más conveniente que contiene todos los componentes del tampón necesarios no solo para una reparación de ADN eficiente, sino también para la reparación del extremo posterior y la cola de dA. P: ¿El módulo FFPE DNA Repair v2 ligará mis fragmentos de ADN? R: La ligasa presente en el módulo FFPE DNA Repair v2 sella eficazmente las mellas en el ADN, pero no es eficaz para ligar fragmentos con desajustes ni para ligar ADN con extremos romos. No hemos observado que esta ligasa ligue ADN con extremos romos. P: ¿Tratar mi ADN con el módulo FFPE DNA Repair v2 perjudicará mi reacción posterior? R: No hemos observado que el módulo FFPE DNA Repair v2 tenga un efecto negativo en la mayoría de las aplicaciones posteriores. La mezcla de reparación solo actuará sobre bases dañadas, mellas y huecos. Sin embargo, en aplicaciones especializadas, como la detección de metilación en muestras dañadas, existe la posibilidad de que la zona de bases rellenada durante la función de traducción de la mella de la reparación pueda borrar las firmas de metilación. Este efecto es más pronunciado en experimentos con bajo aporte de ADN. P: ¿El módulo FFPE DNA Repair v2 roma los extremos del ADN? R: No, la polimerasa presente en el módulo NEBNext FFPE DNA Repair v2 rellenará los salientes 5', pero no eliminará los salientes 3'. Además, esta polimerasa puede añadir un dA al saliente 5' rellenado. P: ¿El módulo FFPE DNA Repair v2 inserta nucleótidos aleatorios en la secuencia que repara? R: No, la polimerasa de la mezcla añade las bases complementarias que corresponden a la cadena molde. La mezcla de reparación no introducirá artefactos en la secuencia. P: ¿El módulo FFPE DNA Repair v2 elimina las modificaciones covalentes de las bases de ADN, como la biotina o la digoxigenina? R: No, esta mezcla de reparación no eliminará las modificaciones covalentes en las bases de ADN. P: ¿La mezcla FFPE DNA Repair v2 repara los enlaces cruzados entre ADN y proteína? R: No, la mezcla de reparación no repara los enlaces cruzados entre ADN y proteína. P: ¿La mezcla FFPE DNA Repair v2 repara los extremos 3' bloqueados? R: Sí, la mezcla de reparación pulirá el extremo 3' a un hidroxilo si hay un bloqueo en dicho extremo. P: ¿Puede la mezcla FFPE DNA Repair v2 reparar daños en ADN monocatenario y bicatenario? ¿O requiere ADN bicatenario como plantilla? R: La actividad reparadora completa de la mezcla FFPE DNA Repair v2 requiere dsADN para la polimerización y la ligación. Sin embargo, las bases dañadas, como las dU presentes en el ssADN, se extirparán durante la reparación y no se incorporarán a la biblioteca de secuenciación. P: Si tuviera una plantilla de ADN con sitios de mutación (p. ej., 8-oxoguanina o citosinas deaminadas) directamente adyacentes en hebras opuestas, ¿el tratamiento con la mezcla FFPE DNA Repair v2 causaría una muesca o rotura en la doble hebra? R: No hemos probado la reparación de sitios de mutación adyacentes en hebras opuestas. En este caso, si las dos bases dañadas se eliminan al mismo tiempo, podría producirse una rotura en la doble hebra, lo que resultaría en ADN fragmentado. Si, por otro lado, una reacción es más rápida que la otra y no ocurren simultáneamente, entonces el FFPE DNA Repair Mix v2 debería repararlas. P: ¿Qué longitudes de gap se pueden reparar con el FFPE DNA Repair v2 Mix? R: Se desconoce la longitud exacta del gap. Según nuestra experiencia, es de entre 5 y 10 nucleótidos. P: ¿Puede el FFPE DNA Repair v2 Module reparar ADN tratado con bisulfito? R: El tratamiento del ADN con bisulfito da como resultado ssDNA que contiene uracilos, que no pueden repararse completamente mediante las actividades de polimerización y ligadura de esta mezcla. Las bases dU presentes en el ssDNA se extirparán, pero no se repararán por completo. P: Al trabajar con ADN fragmentado, ¿el FFPE DNA Repair v2 Module ligará los extremos? R: No, la ligasa de la mezcla solo ligará donde haya una muesca en el dsDNA. P: ¿Cómo repara los sitios abásicos el FFPE DNA Repair v2 Module? R: En el caso del dsADN, la mezcla de reparación reconoce el sitio abásico y corta la cadena principal del ADN. La polimerasa reemplaza la base faltante con la correcta y la ligasa liga el ADN. P: ¿Puedo usar el Módulo de Reparación de ADN FFPE v2 para reparar otros tipos de ADN de baja calidad además del ADN FFPE? R: Sí. La mezcla de reparación reparará muchos tipos de daños en el ADN que se encuentran comúnmente en otros tipos de ADN de baja calidad, como el daño por rayos UV o el daño oxidativo.