New England Biolabs, E7400X, NEBNext® rRNA Depletion Kit v2 (Humano/Ratón/Rata)

La abundancia de ARN ribosómicos (ARNr), que constituyen el 80-90 % del ARN total, requiere su eliminación antes de la secuenciación de nueva generación y otras aplicaciones. Este kit de depleción de ARNr de segunda generación incorpora mejoras en reactivos, sondas y protocolos, lo que resulta en un rendimiento de depleción superior. El eficiente flujo de trabajo basado en ARNasa-H y el espaciamiento reducido de las sondas permiten una depleción eficaz de ARN de baja y alta calidad, con una amplia gama de cantidades de entrada. Categorías relacionadas Depleción de ARN y enriquecimiento de ARNm, Análisis del epitranscriptoma, Preparación de bibliotecas de ARN para Illumina Materiales de especificación necesarios pero no suministrados Pipetas Gradilla magnética (NEB n.º S1515), placa magnética (Alpaqua, cat. n.º A001322) o equivalente Etanol al 80 % (recién preparado) Tubos de PCR de pared fina de 200 μl y tubos de 1,5 ml Microcentrífuga Agitador vórtex Termociclador Bioanalizador, TapeStation (Agilent Technologies, Inc.) o instrumento similar y consumibles Agencourt, RNAClean, XP Beads (Beckman Coulter, Inc. n.º A63987) Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre el kit de depleción de ARNr NEBNext® v2 (humano/ratón/rata) y el kit de depleción de ARNr NEBNext® original (humano/ratón/rata)? R: El kit de depleción de ARNr NEBNext® v2 presenta un diseño de sonda mejorado que se dirige a todas las subunidades del pre-ARNr humano (5S, 5.8S, 18S, 28S, ITS, ETS), una mejor cobertura del ARNr maduro de ratón y rata, y formulaciones enzimáticas mejoradas. P: ¿Para qué especies es compatible el kit de depleción de ARNr NEBNext® v2 (humano/ratón/rata)? ¿Funcionará con otras especies? R: El kit depleciona el ARNr del ARN total de humano, ratón y rata. Es compatible con muestras de otras especies siempre que las secuencias de ARNr sean similares a las de humano, ratón y rata. P: ¿Qué subunidades de ARNr se deplecionan con el kit de depleción de ARNr NEBNext® v2 (humano/ratón/rata)? A: El kit depleta tanto el ARNr citoplasmático (5S, 5.8S, 18S y 28S, ITS humano, ETS) como el mitocondrial (12S y 16S). P: ¿Puedo usar este producto con ARN degradado o ARN fragmentado? R: Sí, este kit se puede usar con ARN degradado o fragmentado. P: ¿Qué entrada de ARN total debo usar? R: El kit ha sido optimizado para 5-1000 ng de ARN total de alta calidad (RIN = 8-9) y 10-1000 ng de ARN degradado o fragmentado (RIN ≤ 2, p. ej., ARN FFPE). P: ¿Por qué el ARN debe estar libre de ADN? R: El ADN contaminante puede causar una cuantificación inexacta del ARN e impedir la eliminación adecuada del ARNm y ARNr de globina. P: ¿Cuál es el rendimiento de ARN esperado recuperado después del agotamiento del ARNr? R: El porcentaje de ARN aislado tras la depleción de ARNr varía según el tipo de ARN (diferentes fuentes o especies de ARN). Normalmente, se observa que se elimina aproximadamente el 98 % del ARNr. P: ¿Cuál es el porcentaje de ARNr restante tras la depleción? R: El porcentaje de ARNr restante tras la depleción varía según la especie. Normalmente, se observa entre un 1 % (humano) y un 3 % (ratón/rata) de ARNr restante. P: ¿Cómo puedo determinar si la depleción de ARNr fue eficiente? R: Para evaluar la eficiencia de la depleción, diseñe cebadores de RT qPCR para el ARNr de la especie de muestra y cebadores para un gen constitutivo. Compare el contenido de ARNr antes y después de la depleción. P: ¿Funciona el kit NEBNext® rRNA Depletion Kit v2 (humano/ratón/rata) para aplicaciones de huella o perfilado ribosómico? R: El protocolo proporcionado con este kit no ha sido validado para la huella o perfilado ribosómico. P: ¿Puedo usar las perlas magnéticas Agencourt® AMPure® XP en lugar de las perlas de purificación de muestras de ARN NEBNext® (perlas magnéticas RNAClean® XP)? R: Sí, es posible usar las perlas AMPure XP. Sin embargo, recomendamos usar las perlas RNAClean XP/perlas de purificación de muestras de ARN NEBNext® (suministradas en NEB n.° E7860), ya que estas perlas han sido fabricadas y probadas para eliminar la contaminación por ARNasa. El kit incluye estas perlas: NEBNext® rRNA Depletion Kit (Bacteria) con perlas de purificación de muestras de ARN (NEB n.° E7860). P: ¿Puedo usar otros métodos de purificación además de las perlas de purificación de muestras de ARN NEBNext®/perlas magnéticas Agencourt® RNAClean® XP? R: Aunque recomendamos usar las perlas RNAClean® XP NEBNext® RNA Sample Purification Beads (suministradas en NEB #E7755), las muestras con ARNr reducido pueden purificarse alternativamente por precipitación con etanol o usando limpiadores de columnas de ARN como el Monarch Spin RNA Cleanup Kit (NEB #T2030). Para usar con otras columnas, revise la especificación de la columna para el rango de tamaño de ARN para asegurar que cualquier ARN fragmentado se conservará durante la limpieza. P: Para eliminar el ARN ribosómico del ARN total, ¿debo usar el NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (NEB #E7490) o el NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (Human, Mouse, Rat)? R: Los NEBNext rRNA Depletion Kits enriquecen para transcripciones poliadeniladas, así como ARN no poliadenilado (como ARN no codificante y transcripciones antisentido). El módulo de aislamiento magnético de ARNm NEBNext Poly(A) solo retiene los transcritos poliadenilados. Los kits de depleción de ARNr NEBNext pueden utilizarse con muestras de ARN total de baja calidad. El módulo de aislamiento magnético de ARNm NEBNext Poly(A) requiere ARN total de alta calidad. P: ¿Puedo utilizar más de un tipo de solución de depleción NEBNext en el proceso de depleción de ARN NEBNext? R: Sí, es posible combinar sondas. Se puede usar cualquier combinación de soluciones de depleción NEBNext (kit de depleción de ARNr NEBNext (humano/ratón/rata) (NEB n.° E7400/E7405); kit de depleción de ARNr NEBNext (bacterias) (NEB n.° E7850/E7860); kit de depleción de globina y ARNr NEBNext (humano/ratón/rata) (NEB n.° E7750/E7755) en el paso de hibridación de la sonda. El volumen de la muestra total durante el paso de hibridación de la sonda debe permanecer constante (15 µl). El volumen del tampón de hibridación de la sonda siempre debe ser de 2 µl. El volumen de las soluciones de depleción individuales debe determinarse experimentalmente con un experimento de titulación de entrada, ya que la cantidad óptima de sondas variará de un tipo de muestra a otro. En ausencia de estos datos experimentales, las sondas se pueden agregar en una proporción de 1:1. Dado que el volumen total de la reacción es 15 µl. El volumen de ARN total que se puede añadir depende del volumen restante tras añadir 2 µl de tampón de hibridación y del volumen de las soluciones de depleción. Si diluye el ARN total en agua sin nucleasas antes de la depleción, puede reducir el volumen de agua sin nucleasas para un mayor volumen de solución de depleción NEBNext. VOLUMEN DE LA REACCIÓN DE HIBRIDACIÓN DE ARN/SONDA: ARN total en agua sin nucleasas (10 ng–1 μg): Variable, hasta 11 μl. Combinación de soluciones de depleción: Variable (blanco). Tampón de hibridación de sonda NEBNext: 2 μl. Volumen total: 15 μl. Consulte el protocolo en el manual NEB n.° E7400, NEB n.° E7750 o NEB n.° E7850. P: ¿Se puede utilizar el ARN enriquecido resultante del kit de depleción NEBNext en la secuenciación de lecturas largas? ¿Aplicaciones? R: Sí, pero tenga en cuenta que el ARN se fragmenta ligeramente durante el proceso de depleción. Esto puede reducir la longitud de lectura.