New England Biolabs, E7410S, Kit de preparación de biblioteca de ADN sin PCR NEBNext® Ultra™ II para Illumina®

El kit de preparación de bibliotecas de ADN sin PCR NEBNext Ultra II para Illumina ofrece un flujo de trabajo sin amplificación para la secuenciación de ADN, basado en el flujo de trabajo optimizado y fiable de Ultra II. A partir de tan solo 250 ng de ADN, obtenga las bibliotecas de alta calidad y alto rendimiento que necesita sin sesgo de PCR. Categorías relacionadas: Validación de la edición genética basada en CRISPR, Preparación de bibliotecas de ADN para Illumina, Automatización para la preparación de bibliotecas NEBNext® NGS, Preguntas frecuentes. P: ¿Cuál es la principal aplicación del kit de preparación de bibliotecas de ADN sin PCR NEBNext Ultra II? R: El kit de preparación de bibliotecas de ADN sin PCR NEBNext Ultra II está optimizado para la preparación de bibliotecas de alta calidad y sin amplificación para la secuenciación del genoma completo en las plataformas Illumina. P: ¿Qué reactivos adicionales necesito para completar el flujo de trabajo sin PCR de ADN Ultra II? R: Además del kit de preparación de bibliotecas de ADN sin PCR NEBNext Ultra II, necesitará los oligonucleótidos multiplex NEBNext para Illumina (conjunto de adaptadores de ADN de índice dual único 1) (NEB n.° E7395) para completar el flujo de trabajo. Tenga en cuenta que los demás oligonucleótidos de NEB no son compatibles con el flujo de trabajo sin PCR. P: ¿Se pueden utilizar muestras degradadas para la preparación de bibliotecas de ADN sin PCR con Ultra II? R: No, no recomendamos muestras degradadas como material de entrada para el flujo de trabajo sin PCR. El uso de ADN degradado de baja calidad podría resultar en rendimientos significativamente menores y pérdida de muestras durante los pasos de limpieza. P: ¿Qué tipo y en qué cantidad de material de partida necesito para preparar bibliotecas con el kit de preparación de bibliotecas de ADN sin PCR NEBNext Ultra II? R: Este kit es adecuado para 250 ng – 1 µg de ADN fragmentado de alta calidad. P: ¿Qué métodos de cizallamiento recomiendan para el flujo de trabajo sin PCR con NEBNext Ultra II? R: El protocolo está optimizado para el cizallamiento mediante fragmentación Covaris. Para la fragmentación enzimática, utilice nuestro kit de preparación de bibliotecas NEBNext® Ultra™ II FS DNA PCR-free para Illumina® (NEB n.° E7430). P: ¿Para qué tipo de preparación de muestras/construcción de bibliotecas puedo utilizar el kit de preparación de bibliotecas NEBNext Ultra II DNA PCR-free para Illumina? R: El kit de preparación de bibliotecas NEBNext Ultra II DNA PCR-free para Illumina es compatible con protocolos que requieren un saliente 3' A en las moléculas de la biblioteca para facilitar la ligación a adaptadores que contienen un saliente 3' T, como la preparación de bibliotecas para secuenciación en la plataforma Illumina. Actualmente, hemos validado el kit de preparación de bibliotecas Ultra II DNA PCR-free solo en la plataforma Illumina. P: ¿Qué hago si veo un precipitado en el tampón de reacción de preparación de extremos Ultra II? R: Es frecuente ver un precipitado blanco en el tampón de reparación de extremos Ultra II. Si esto ocurre, deje que la mezcla alcance la temperatura ambiente y pipetee el tampón varias veces para disolver el precipitado, seguido de un vórtex rápido para mezclar. P: Siguiendo los pasos de preparación final del flujo de trabajo sin PCR de ADN NEBNext Ultra II, ¿se pueden mantener las reacciones a 4 ˚C? R: No. Recomendamos pasar inmediatamente al paso de ligadura del adaptador una vez que la temperatura de reacción alcance los 4 ˚C. Dejar el ADN preparado finalmente a 4 ˚C podría resultar en rendimientos de biblioteca más bajos. P: La reacción de ligadura es muy viscosa. ¿Qué sucederá si no se mezcla correctamente? R: Si la reacción de ligadura no se mezcla correctamente, pueden resultar bajos rendimientos de biblioteca. Para asegurar una mezcla adecuada, la reacción se puede pipetear arriba y abajo 10 veces o agitar en vórtex durante 3 segundos. P: Después del paso de ligadura del adaptador, ¿se pueden mantener las reacciones a 4 ˚C? R: No. Recomendamos pasar inmediatamente a los pasos de limpieza de microesferas una vez que la temperatura de reacción alcance los 4 ˚C. P: ¿Puedo usar el kit de preparación de bibliotecas de ADN sin PCR NEBNext Ultra II para preparar bibliotecas para secuenciación en los instrumentos de secuenciación Ion Torrent? R: No, los adaptadores necesarios para la secuenciación Ion Torrent tienen extremos romos, en lugar de salientes 5'-T, y no son compatibles con el flujo de trabajo sin PCR de NEBNext Ultra II. P: ¿Cómo cuantifico mis bibliotecas sin PCR? R: Solo los métodos basados ​​en qPCR (como el kit NEBNext Library Quant para Illumina (NEB n.° E7630)) pueden usarse para la cuantificación precisa de bibliotecas sin PCR. Otros métodos cuantifican fragmentos que pueden no tener adaptadores en ambos extremos y, por lo tanto, no generan clústeres ni secuencias. P: ¿Puedo evaluar la calidad de las bibliotecas sin PCR en un BioAnalyzer o TapeStation? R: Se deben tomar precauciones al usar BioAnalyzer y TapeStation para evaluar la calidad de las bibliotecas sin PCR. Bioanalyzer y TapeStation pueden ser útiles para revelar si las bibliotecas libres de PCR están contaminadas con adaptadores sobrantes o dímeros de adaptadores. Sin embargo, la estimación del tamaño y la cuantificación de las bibliotecas no son precisas en Bioanalyzer y TapeStation. La región monocatenaria larga de los adaptadores libres de PCR interfiere con la migración de las bibliotecas libres de PCR, haciéndolas parecer mucho más grandes. Además, Bioanalyzer y TapeStation no pueden diferenciar entre fragmentos de ADN de entrada y fragmentos de ADN con uno o dos adaptadores ligados, lo que los hace inadecuados para la cuantificación. Recomendamos la qPCR para la cuantificación de bibliotecas libres de PCR. P: ¿Puedo usar este kit NEBNext libre de PCR con adaptadores de otros proveedores? R: Sí, es posible usar adaptadores de otros proveedores con este kit de preparación de bibliotecas libre de PCR NEBNext. Los adaptadores deben ser adaptadores con saliente T y contener todas las secuencias necesarias para la secuenciación en plataformas Illumina. P: ¿Están disponibles estos reactivos en formato personalizado, mayor o de 96 pocillos? R: Sí, se pueden adaptar formatos personalizados. Para más información, contacte con nuestro departamento OEM en custom@neb.com. P: ¿El kit sin PCR incluye adaptador y cebadores? R: No. El kit es compatible con los adaptadores NEBNext Unique Dual Index UMI para Illumina. Para obtener una lista completa de oligos compatibles, consulte la columna derecha de la tabla de selección de oligos multiplex NEBNext®. Los manuales de los adaptadores NEBNext Unique Dual Index UMI también incluyen consejos para configurar las reacciones de ligación. Para usar con los kits de preparación de bibliotecas NEBNext, consulte el manual del kit. Para ver las opciones de balance de color, consulte el selector de oligos de índice NEBNext® para ver las combinaciones de códigos de barras válidas.