New England Biolabs, E7416S, NEBNext® Multiplex Oligos para Illumina (Conjunto 1 de adaptadores de ARN UMI de índice dual único)

Categorías relacionadas con NEBNext: Oligonucleótidos multiplex NEBNext® (adaptadores y cebadores), preguntas frecuentes sobre la preparación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación. P: ¿Cuáles son las ventajas de los adaptadores UMI? R: Para representar mejor los niveles reales de abundancia de transcripción, se pueden utilizar identificadores moleculares únicos (UMI) para distinguir los duplicados de PCR de las lecturas que se originan en moléculas originales distintas. La identificación precisa de estos artefactos puede tener un impacto significativo en la cuantificación de la abundancia de transcripción y, posteriormente, en los análisis de expresión diferencial, especialmente para genes de baja abundancia. P: ¿Con qué kits de preparación de bibliotecas son compatibles los adaptadores UMI de doble índice único NEBNext® para ARN? R: Los adaptadores UMI de doble índice único NEBNext® para ARN son compatibles con los kits de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext® Ultra II (NEB n.° E7760, E7770) con enriquecimiento de ARNm poli(A) (NEB n.° E7490) o depleción de ARNr (NEB n.° E7400, NEB n.° E7490, E6350, NEB n.° E7750, NEB n.° E7850). P: ¿Cómo puedo reducir el dímero del adaptador? R: Durante la ligadura, la mezcla maestra de ligadura y el potenciador de ligadura se pueden mezclar antes de preparar la reacción, pero asegúrese de no añadir el adaptador a la mezcla maestra antes de preparar la reacción. Mantenga todos los reactivos y tampones en hielo a menos que se indique lo contrario y asegúrese de que la reacción de ligadura se prepare en hielo. Es más común ver dímeros de adaptador con entradas bajas. Si hay dímero adaptador, complete el volumen de las bibliotecas a 50 μl con tampón TE 0,1x y repita los pasos de limpieza con SPRIselect Bead o NEBNext Sample Purification Bead. Como alternativa, especialmente para material valioso y de bajo aporte, las muestras se pueden agrupar y realizar una segunda limpieza con 0,9x de volumen de perlas antes de cargar el secuenciador. P: ¿Disponen de hojas de muestra para usar con los oligos multiplex NEBNext® para Illumina® (Set 1 de 96 adaptadores de ARN UMI de índice dual único)? R: Sí, las hojas de muestra con las secuencias índice para NovaSeq®, MiSeq®, HiSeq® 2000 y HiSeq 2500 están disponibles con y sin la secuencia UMI. Las hojas de muestra con las secuencias índice para NextSeq®, MiniSeq®, HiSeq 3000 y HiSeq 4000 están disponibles con y sin la secuencia UMI. P: ¿Los adaptadores UMI de doble índice único NEBNext® para ARN están validados en los flujos de trabajo de secuenciación de nueva generación? R: Sí, los adaptadores UMI de doble índice único NEBNext® para Illumina se validan mediante la creación de bibliotecas de RNAseq, seguidas de la secuenciación de Illumina. P: ¿Son los adaptadores UMI de doble índice único NEBNext® para ARN compatibles con la secuenciación de lectura única y de extremo emparejado? R: Sí, los adaptadores UMI de ARN de doble índice único NEBNext® para Illumina son compatibles tanto con la secuenciación de lectura única como con la de extremo emparejado. P: ¿Cuáles son las concentraciones del adaptador y los cebadores en el kit? R: La concentración del adaptador UMI de doble índice único que se encuentra en el conjunto de ARN 1 de adaptadores UMI de doble índice único NEBNext® es de 1 μM y la concentración de la mezcla de cebadores de PCR es de 40 μM. P: ¿Cuántas reacciones de adaptador hay en cada pocillo? R: Se proporciona una cantidad suficiente de adaptador para al menos una reacción con la entrada máxima de 1 μg de ARN. P: ¿Está metilado el adaptador NEBNext? R: No, el adaptador NEBNext® en los NEB n.° E6440, E6442, E6444, E6446 y E6448 no está metilado y, por lo tanto, no es compatible con los protocolos de secuenciación con bisulfito. Se suministra una versión metilada del adaptador NEBNext, junto con los cebadores índice, en el NEB n.° E7535. P: ¿Cuántos índices están disponibles con los oligonucleótidos multiplex NEBNext® para Illumina® (conjunto de ARN de 96 adaptadores UMI de índice dual único 1) NEB n.° 7416? R: Cada módulo consta de 96 índices duales únicos. La placa E7416S contiene 96 índices i5 únicos y 96 índices i7 únicos en combinación. Esta combinación de índices únicos i5 e i7 minimiza los saltos de índice. El kit E7416L contiene cuatro placas con las mismas 96 combinaciones únicas de índices i5 e i7. P: ¿Es el adaptador UMI de doble índice único NEBNext® para ARN compatible con los kits de preparación de bibliotecas de otros fabricantes? R: Sí, el adaptador UMI de doble índice único NEBNext® es compatible con otros métodos de preparación de bibliotecas además de los productos NEBNext®. Siga los protocolos del fabricante, sustituyendo los adaptadores UMI NEBNext en las concentraciones que este especifique. P: ¿Son las bibliotecas de doble índice compatibles con la secuenciación de un solo extremo? R: Sí, los oligos NEBNext para Illumina, incluidos los oligos de doble índice, son compatibles con la secuenciación de una sola lectura. Consulte la Guía general de secuenciación indexada de Illumina (versión actual) para obtener detalles sobre los flujos de trabajo de secuenciación de doble índice en una celda de flujo de una sola lectura o en una celda de flujo de dos extremos. P: ¿Qué secuencias deben recortarse para las bibliotecas NEBNext que se secuencian en un instrumento Illumina? R: Las bibliotecas NEBNext para Illumina se parecen a las bibliotecas TruSeq y se pueden recortar como TruSeq: Adaptador Read1 AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA Adaptador Read2 AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT P: ¿Qué hago si recibo un error de colisión de índice/colisión de código de barras? R: Si recibió un error de colisión de índice al demultiplexar los oligonucleótidos multiplexados NEBNext, actualice a: Versión de software Bclconvert 4.1.7 o posterior Bcl2fastq Cualquier versión Picard IlluminaBasecallsToSam Cualquier versión Comuníquese con el soporte técnico si tiene más preguntas.