New England Biolabs, E7430L, Kit de preparación de biblioteca de ADN sin PCR NEBNext® Ultra™ II FS para Illumina®

El kit de preparación de bibliotecas de ADN sin PCR NEBNext Ultra II FS para Illumina ofrece un flujo de trabajo sin amplificación para la secuenciación de ADN, basado en el flujo de trabajo optimizado y fiable de Ultra II FS. A partir de tan solo 50 ng de ADN, obtenga las bibliotecas de alta calidad y alto rendimiento que necesita sin sesgo de PCR. Categorías relacionadas : Validación de la edición genética basada en CRISPR, Preparación de bibliotecas de ADN para Illumina, Automatización para la preparación de bibliotecas NEBNext® NGS, Preguntas frecuentes . P: ¿Cuál es la principal aplicación del kit de preparación de bibliotecas de ADN sin PCR NEBNext Ultra II FS? R: El kit de preparación de bibliotecas de ADN sin PCR NEBNext Ultra II FS está optimizado para la preparación de bibliotecas de alta calidad y sin amplificación para la secuenciación del genoma completo en las plataformas Illumina. P: ¿Qué reactivos adicionales necesito para completar el flujo de trabajo sin PCR de ADN Ultra II FS? R: Además del kit de preparación de bibliotecas de ADN sin PCR NEBNext Ultra II FS, necesitará los oligonucleótidos multiplex NEBNext para Illumina (conjunto de adaptadores de ADN UMI de índice dual único 1) (NEB n.° E7395) para completar el flujo de trabajo. Tenga en cuenta que los demás oligonucleótidos de NEB no son compatibles con el flujo de trabajo sin PCR. P: ¿Por qué se incluye DTT en el kit Ultra II FS DNA sin PCR? R: La adición de DTT en el paso de fragmentación/preparación final ayuda a lograr los tamaños de inserto largos necesarios para las bibliotecas sin PCR. P: ¿Se pueden usar muestras degradadas para la preparación de bibliotecas de ADN sin PCR Ultra II FS? R: No, no recomendamos muestras degradadas como material de entrada para el flujo de trabajo sin PCR. El uso de ADN degradado de baja calidad podría resultar en rendimientos significativamente menores y pérdida de muestras durante los pasos de limpieza. P: ¿Qué tipo y en qué cantidad de material de partida necesito para preparar bibliotecas con el kit de preparación de bibliotecas de ADN sin PCR NEBNext Ultra II FS? R: Este kit es adecuado para 100 ng – 0,5 µg de ADN intacto de alta calidad utilizando el protocolo estándar. Además, ofrecemos un protocolo de bajo aporte (50-99 ng) para ayudar a los usuarios que no pueden obtener suficiente muestra para el protocolo estándar. P: Al preparar muestras con el kit de preparación de bibliotecas de ADN sin PCR NEBNext Ultra II FS, ¿puedo utilizar mi ADN de entrada en una solución que contenga EDTA? R: Sí, recomendamos que el ADN esté en TE 1X o TE con bajo contenido de EDTA. El ADN también puede estar en Tris 10 mM pH 7,0-8,0 o H₂O. P: ¿Qué hago si veo un precipitado en el tampón de reacción Ultra II FS? R: No es raro ver precipitados en el tampón de reacción Ultra II FS. Si esto ocurre, pipetee el tampón varias veces para disolver el precipitado y, a continuación, agite rápidamente para mezclar. Es posible que aún se observe una pequeña cantidad de precipitación, pero esto no afectará el rendimiento. P: ¿Es realmente necesario agitar la mezcla enzimática Ultra II FS en vórtex? R: Sí, si no se agita la mezcla enzimática Ultra II FS en vórtex, los resultados pueden variar. P: Tras los pasos de fragmentación y preparación final del flujo de trabajo sin PCR de NEBNext Ultra II FS, ¿se pueden mantener las reacciones a 4 °C? R: No. Recomendamos pasar inmediatamente al paso de ligadura del adaptador una vez que la temperatura de reacción alcance los 4 °C. Dejar el ADN preparado en el extremo a 4 °C podría resultar en un menor rendimiento de la biblioteca. P: La reacción de ligadura es muy viscosa. ¿Qué ocurrirá si no se mezcla correctamente? R: Si la reacción de ligadura no se mezcla correctamente, el rendimiento de la biblioteca puede ser bajo. Para asegurar una mezcla adecuada, la reacción se puede pipetear 10 veces o agitar en vórtex durante 3 segundos. P: Tras el paso de ligadura del adaptador, ¿se pueden mantener las reacciones a 4 °C? R: No. Recomendamos pasar inmediatamente a los pasos de limpieza de microesferas una vez que la temperatura de reacción alcance los 4 °C. P: ¿Puedo usar el kit de preparación de bibliotecas NEBNext Ultra II FS DNA PCR-free para la conversión con bisulfito o los flujos de trabajo EM-seq™? R: No, el kit Ultra II FS DNA PCR-free no es compatible con la conversión con bisulfito ni con los flujos de trabajo EM-seq. Recomendamos usar cizallamiento mecánico y el kit de preparación de bibliotecas NEBNext Ultra II (NEB n.° E7645) para esta aplicación. P: ¿Puedo usar el kit de preparación de bibliotecas NEBNext Ultra II FS DNA PCR-free para preparar bibliotecas para la secuenciación en los instrumentos de secuenciación Ion Torrent? R: No, los adaptadores necesarios para la secuenciación Ion Torrent tienen extremos romos, en lugar de salientes 3'-T, y no son compatibles con el flujo de trabajo Ultra II FS DNA PCR-free. P: ¿Cómo cuantifico mis bibliotecas sin PCR? R: Solo los métodos basados ​​en qPCR (como el NEBNext Library Quant Kit para Illumina (NEB n.º E7630)) pueden utilizarse para la cuantificación precisa de bibliotecas libres de PCR. Otros métodos cuantificarán fragmentos que pueden no tener adaptadores en ambos extremos y, por lo tanto, no generarán clústeres ni secuencias. P: ¿Puedo evaluar la calidad de la biblioteca libre de PCR en un BioAnalyzer o TapeStation? R: Se deben tomar precauciones al utilizar Bioanalyzer y TapeStation para evaluar la calidad de las bibliotecas libres de PCR. Bioanalyzer y TapeStation pueden ser informativos para revelar si las bibliotecas libres de PCR están contaminadas con adaptadores sobrantes o dímeros de adaptadores. Sin embargo, la estimación del tamaño y la cuantificación de la biblioteca no son precisas en Bioanalyzer y TapeStation. La región larga y monocatenaria de los adaptadores libres de PCR interfiere con la migración de las bibliotecas libres de PCR, haciéndolas parecer mucho más grandes. Además, Bioanalzyer y TapeStation no pueden diferenciar entre fragmentos de ADN de entrada y fragmentos de ADN con uno o dos adaptadores ligados, lo que los hace inadecuados para la cuantificación. Recomendamos la qPCR para la cuantificación de bibliotecas libres de PCR. P: ¿Puedo usar este kit NEBNext PCR-free con adaptadores de otros proveedores? R: Sí, es posible usar adaptadores de otros proveedores con este kit de preparación de bibliotecas NEBNext PCR-free. Los adaptadores deben ser adaptadores con saliente T y contener todas las secuencias necesarias para la secuenciación en plataformas Illumina. P: ¿El kit PCR-free incluye adaptador y cebadores? R: No. El kit se puede usar con los adaptadores NEBNext Unique Dual Index UMI para Illumina. Para obtener una lista completa de oligos compatibles, consulte la columna de la derecha de la Tabla de selección de oligos multiplex NEBNext®. Los manuales de los adaptadores NEBNext Unique Dual Index UMI también contienen consejos para configurar las reacciones de ligadura. Para usar los kits de preparación de bibliotecas NEBNext, consulte el manual del kit. Para ver las opciones de balance de color, consulte el Selector de Oligonucleótidos de Índice NEBNext® para ver las combinaciones de códigos de barras válidas.