New England Biolabs, E7546L, módulo de reparación de extremos/cola de dA NEBNext® Ultra™ II

Este módulo es parte de Ultra Categorías relacionadas Preparación de biblioteca de ADN para Illumina,, Preparación de biblioteca de ARN para Illumina,, Especificación de preparación de biblioteca de secuenciación de próxima generación Materiales necesarios pero no suministrados Gradilla o placa magnética (p. ej., Gradilla de separación magnética NEBNext ® (NEB n.º S1515S), placa supermagnética Alpaqua ® 96S (n.º A001322) o equivalente) Preguntas frecuentes P: Hay 3 módulos de ligadura NEBNext: el módulo de ligadura NEBNext Ultra II (n.º E7595), el módulo de ligadura NEBNext Ultra (n.º E7445) y el módulo de ligadura rápida NEBNext (n.º E6056). ¿Qué módulo se debe utilizar junto con el módulo de reparación de extremos/cola de dA NEBNext Ultra II? R: El módulo de reparación de extremos/cola de dA NEBNext Ultra II se debe utilizar con el flujo de trabajo Ultra II. Este módulo está diseñado para usarse con el módulo de ligadura NEBNext Ultra II (#E7595) y es compatible con el flujo de trabajo Ultra II. El módulo de ligadura NEBNext Ultra (#E7445) y el módulo de ligadura rápida NEBNext (#E6056) no son compatibles con el flujo de trabajo Ultra II. P: ¿Cómo se limpia la reacción una vez finalizada? R: El módulo está diseñado para conectarse directamente al módulo de ligadura NEBNext Ultra II (#E7595), por lo que no requiere limpieza. Para usar con flujos de trabajo que no sean Ultra II, utilice el siguiente protocolo de limpieza con SpriSelect o perlas AMPure XP® (Beckman Coulter, Inc.): Para usar con perlas AMPure XP, deje que las perlas alcancen la temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes de usarlas. Agite las perlas en vórtex para resuspenderlas. Añada 108 μl (1.8X) de perlas resuspendidas a la reacción de ligadura. Mezcle bien en un mezclador vórtex o pipeteando arriba y abajo al menos 10 veces. Incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. Coloque el tubo/placa PCR en un soporte magnético adecuado para separar las perlas del sobrenadante. Después de que la solución esté transparente (aproximadamente 5 minutos), retire con cuidado y deseche el sobrenadante. Tenga cuidado de no alterar las perlas que contienen los objetivos de ADN. Agregue 200 μl de etanol al 80% recién preparado al tubo/placa PCR mientras está en el soporte magnético. Incube a temperatura ambiente durante 30 segundos y luego retire con cuidado y deseche el sobrenadante. Repita el paso 6 una vez. Seque las perlas al aire durante 5 minutos mientras el tubo/placa PCR está en el soporte magnético con la tapa abierta. Precaución: No seque demasiado las perlas. Esto puede resultar en una menor recuperación del objetivo de ADN. Retire el tubo/placa del imán. Eluya el objetivo de ADN de las perlas agregando 47 μl de Tris-HCl 10 mM o TE 0,1X. Mezcle bien en un mezclador vórtex o pipeteando verticalmente e incube durante 2 minutos a temperatura ambiente. Coloque el tubo/placa de PCR en el soporte magnético hasta que la solución esté transparente. Sin alterar el sedimento de microesferas, transfiera con cuidado 42 μl del sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo y estéril. P: ¿Puedo almacenar la reacción una vez finalizada en el termociclador (es decir, cuando alcance la temperatura de 4 °C)? R: Si es necesario, las muestras se pueden almacenar a -20 °C; sin embargo, se puede observar una ligera pérdida de rendimiento (~20 %). Recomendamos continuar con la ligadura del adaptador o limpiar la reacción antes de detenerla. P: ¿Qué hago si veo un precipitado en el tampón de reacción de preparación de extremos Ultra II? R: No es raro ver un precipitado blanco en el tampón de reparación de extremos Ultra II. Si esto ocurre, deje que la mezcla alcance la temperatura ambiente y pipetee el tampón varias veces para disolver el precipitado, seguido de un vórtex rápido para mezclar.