New England Biolabs, E7630L, Kit de cuantificación de biblioteca NEBNext® para Illumina®

La cuantificación precisa de bibliotecas de secuenciación de próxima generación (NGS) es esencial para maximizar la salida de datos y la calidad de cada ejecución de secuenciación. Para Illumina Categorías relacionadas Cuantificación de bibliotecas NGS,, Especificación de preparación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación Materiales necesarios pero no suministrados Agua libre de nucleasas Máquina de qPCR Placas y sellos de qPCR Tubos de tiras de PCR o tubos de microcentrífuga Tubos cónicos de centrífuga Preguntas frecuentes P: ¿En qué se diferencian los nuevos 6 estándares de los antiguos 4 estándares? R: Los nuevos 6 estándares son una expansión de los antiguos 4 estándares, que aumenta el rango de cuantificación dinámica en 100 veces, de 0,01 pM - 10 pM a 0,001 pM - 100 pM. Tenga en cuenta que los nuevos estándares 2, 3, 4 y 5 son equivalentes a los antiguos estándares 1, 2, 3 y 4 (con NEB n.º E7534, E7535, E7536 y E7537, respectivamente). P: ¿Cuáles son las ventajas de los kits NEBNext Library Quant basados ​​en qPCR en comparación con otros métodos de cuantificación de bibliotecas NGS? R: La qPCR se considera el método más preciso y eficaz de cuantificación de bibliotecas. La consistencia y reproducibilidad de la cuantificación son considerablemente mayores con la qPCR que con la electroforesis o la espectrofotometría, que miden la concentración total de ácidos nucleicos. Los métodos basados ​​en la amplificación cuantifican solo las moléculas que contienen ambas secuencias adaptadoras, lo que proporciona una estimación más precisa de la concentración de la biblioteca que se puede secuenciar. Dado que los experimentos de qPCR se pueden configurar en placas de 96 pocillos, también es más adaptable a flujos de trabajo de alto rendimiento. En comparación con otros métodos de qPCR, se han incorporado varias mejoras adicionales a los kits para mayor comodidad: Los kits NEBNext Library Quant incluyen un práctico tampón de dilución de bibliotecas concentrado. Las mezclas maestras de qPCR están formuladas para requerir únicamente la adición de cebadores (no se requiere pipeteo adicional para añadir agua a cada reacción). Se puede utilizar un único tiempo de extensión para todas las bibliotecas, independientemente de su tamaño. P: ¿Qué bibliotecas se pueden cuantificar con el kit NEBNext® Library Quant para Illumina®? R: Cualquier biblioteca que contenga las secuencias adaptadoras estándar de Illumina P5 y P7 se puede cuantificar con el kit. Las bibliotecas se pueden preparar utilizando cualquier método deseado, siempre que se introduzcan estas secuencias adaptadoras. La cuantificación con el Quant Kit se ha realizado con éxito utilizando varios kits de construcción de bibliotecas, incluidos los que se enumeran a continuación: Fabricante Kit de preparación de biblioteca New England Biolabs® NEBNext® Ultra™ II DNA NEBNext Ultra II FS NEBNext Enzymatic Methyl-seq (EM-seq™) NEBNext Immune Sequencing NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 NEBNext Ultra II Directional RNA NEBNext Ultra II RNA NEBnext Single Cell/Low Input RNA Clontech SMARTer® Stranded Total RNA KAPA™ Hyper HyperPlus Thermo Scientific® MuSeek Illumina® Nextera Rapid Capture ScriptSeq™ v2 TruSeq DNA PCR-free TruSeq Nano® TruSeq RNA v2 TruSeq RNA Access TruSight® Rapid Capture Illumina PCR-free Takara Prep™ ILM DNA Una amplia variedad de material genómico de entrada es compatible con el Quant Kit. El rendimiento del kit se validó utilizando bibliotecas con un tamaño de entre 140 y 1000 pb y un 20-70 % de GC. El material de entrada puede ser bibliotecas de ARNs, ADN FFPE o ADNg de cualquier fuente de interés, incluyendo las de GC extremas, como Plasmodium y Rhodopseudomonas. P: ¿Cuánto debo diluir mi biblioteca para analizarla en el Quant Kit? R: Recomendamos una dilución inicial de 1:1000 de la biblioteca utilizando el tampón de dilución de biblioteca proporcionado. Para la mayoría de las preparaciones de bibliotecas, esto resultará en una biblioteca >10 pM, por lo que recomendamos dos diluciones seriadas más de 1:10, lo que resulta en diluciones finales de 1:10 000 y 1:100 000. Para nuevos protocolos y bibliotecas, recomendamos analizar ambas diluciones en el Quant Kit. Con flujos de trabajo más consolidados o para maximizar el número de bibliotecas cuantificadas, a menudo es posible utilizar únicamente la dilución 1:100.000 para la cuantificación. Si se desean diluciones personalizadas, asegúrese de que las bibliotecas diluidas finales se encuentren dentro del rango de los estándares (100 pM – 1 fM). P: ¿Puedo utilizar el kit NEBNext Library Quant en mi equipo de qPCR? R: El kit Quant es compatible con todos los instrumentos de qPCR probados hasta la fecha, ya sea con protocolos estándar o de rampa de temperatura rápida. Para equipos que utilizan un colorante de referencia para la normalización, consulte el manual del kit o las preguntas frecuentes sobre ROX para seleccionar el ROX adecuado. El Quant Kit se ha ejecutado con éxito en las siguientes máquinas de qPCR: Fabricante Instrumento Applied Biosystems® StepOne™ StepOnePlus™ Prism® 7000 Prism 7900HT 7500 Fast ViiA™ 7 Bio-Rad iQ® 5 CFX96™ CFX384™ Life Technologies QuantStudio™ 7 Roche LightCycler® 96 LightCycler 480 Póngase en contacto con nosotros en info@neb.com si desea hablar sobre el rendimiento en cualquier instrumento de qPCR no mencionado anteriormente. P: ¿Qué ROX debo usar para mi máquina de qPCR? R: Proporcionamos tubos separados de colorante de normalización ROX en dos concentraciones (baja, alta) para permitir el uso en todas las plataformas de qPCR. Consulte la tabla a continuación para determinar si se requiere ROX y, de ser así, qué concentración se debe utilizar: qPCR Instrument ROX Bio-Rad® iQ™5, CFX96, CFX384, Opticon Roche Lightcycler® Qiagen Rotor-Gene™ Eppendorf Mastercycler® Cepheid® SmartCycler® No recomendado Applied Biosystems® 7500, QuantStudio™, ViiA7™ Agilent Mx™ Low ROX Applied Biosystems® 7000, 7300, 7700, 7900HT, StepOne™, StepOnePlus™ High ROX P: ¿Son suficientes 4 estándares para una cuantificación de qPCR? R: Sí. Aunque recomendamos usar 6 estándares (100 pM – 0,001 pM), las curvas estándar generadas a partir de 4 estándares (10 pM – 0,01 pM) son suficientes para obtener una medición fiable de la concentración de la biblioteca. Incluso si un estándar presenta un valor atípico en la curva debido a problemas de configuración, los otros 3 pueden usarse con confianza. El rango de concentraciones de estándar que se incluye en el kit cubre todas las bibliotecas preparadas con métodos y kits estándar que siguen las directrices del kit para realizar diluciones de bibliotecas. P: ¿Se requiere una corrección de tamaño para el cuantizador de la biblioteca? R: Sí. El colorante intercalante utilizado en el kit se une al ADN en proporción al número de pares de bases por producto de ADN bicatenario, por lo que es necesario corregir la longitud del producto normalizándolo al tamaño del estándar de ADN, 399 pb. Todos los cuantizadores se multiplican simplemente por un factor de corrección de 399 pb/tamaño de la biblioteca. Esto se realiza automáticamente con nuestra calculadora en línea. P: ¿Qué otros materiales o información necesito para ejecutar un kit de cuantizador de biblioteca NEBNext®? R: Es necesario conocer el tamaño promedio de la biblioteca, por lo que el análisis con un Bioanalizador Agilent, TapeStation o un instrumento similar resulta útil. Se proporciona un tampón de dilución de biblioteca concentrado que debe diluirse con agua libre de nucleasas. Se requiere un instrumento de qPCR con placas y sellos adecuados, así como equipo de laboratorio estándar como pipetas, puntas y tubos cónicos. P: ¿Cuántas bibliotecas puedo cuantificar a la vez? R: Recomendamos realizar 2 diluciones de cada biblioteca y cada una por triplicado. Por lo tanto, se pueden cuantificar 12 (con 6 estándares) o 13 (con 4 estándares) bibliotecas en una placa de 96 pocillos. Una vez establecido el flujo de trabajo, se podría realizar una sola dilución, lo que permite 25 (con 6 estándares) o 27 (con 4 estándares) bibliotecas por placa de 96 pocillos. P: ¿Cuánto dura una ejecución del Quant Kit? R: Estimamos un tiempo total de ejecución de principio a fin de 1 h 45 min. De esto, el tiempo práctico es <45 min, y 1 h será tiempo de máquina ocupado por la ejecución de qPCR. P: ¿Proporcionan alguna herramienta de análisis para ayudar con la cuantificación? R: Sí, tenemos una calculadora sencilla de qPCR Library Quant con nuestro paquete de NEBioTools. Para usar la herramienta de cuantificación de qPCR, solo necesita el Cq para cada estándar y biblioteca, el factor de dilución para cada muestra y el tamaño de la biblioteca para la corrección de tamaño. La herramienta es autónoma y los datos no salen de su navegador. P: ¿Puedo ver los dímeros adaptadores como una medida de la calidad de la biblioteca? R: Sí. Si bien no se requiere una curva de fusión para el kit, y omitirla reducirá los tiempos de ejecución, los datos del análisis de fusión se pueden usar para obtener información sobre la calidad de la biblioteca. Cuando los dímeros adaptadores están presentes en >5% de la muestra de la biblioteca, se puede observar un único pico de fusión agudo a 81,5 °C. En todos los demás casos, se producirá una curva de fusión amplia o con múltiples picos, indicativa del rango y la diversidad de la biblioteca que se está amplificando. P: ¿Cuánto tiempo puedo conservar la mezcla maestra después de añadir los cebadores? R: Una vez añadidos los cebadores del kit Quant a la mezcla maestra, la solución Mix+Primers es estable durante 6 semanas a 4 °C para mayor comodidad. Si prevé tiempos más largos entre análisis, consérvela a –20 °C hasta 7 meses. P: ¿Se puede comprar por separado el tampón de dilución de la biblioteca NEBNext? R: Sí, además del tampón de dilución incluido en el kit, se puede comprar por separado. El número de referencia es B6118S. Es una botella de 7,5 ml y se puede comprar aquí.