New England Biolabs, E7645L, Kit de preparación de biblioteca de ADN NEBNext® Ultra™ II para Illumina®

¿Tiene dificultades para intentar obtener mayores rendimientos de la biblioteca utilizando cantidades de entrada cada vez menores? Cada componente en las categorías relacionadas con NEBNext Validación de edición genética basada en CRISPR, Preparación de bibliotecas de ADN para Illumina, Análisis de cromatina, Materiales de especificación necesarios pero no suministrados Etanol al 80 % (recién preparado) Agua sin nucleasas 0,1X TE (1 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) Tubos DNA LoBind (Eppendorf n.º 022431021) Oligonucleótidos NEBNext singleplex o multiplex para Illumina (NEB n.º E7350, E7335, E7500, E7600, E6609, E7710 o E7730) Gradilla o placa magnética (p. ej., Gradilla de separación magnética NEBNext® (NEB n.º S1515S), Placa supermagnética Alpaqua ® 96S (n.º A001322) o equivalente) Máquina de PCR Solo para NEB n.º E7645: Kit de reactivos SPRIselect® (Beckman Coulter, Inc. n.º B23317) o perlas AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. n.º A63881). Opcional: Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 o Tris/NaCl, pH 8,0 (Tris 10 mM, NaCl 10 mM) (para dilución del adaptador de entrada de ADN ≤ 100 ng). Preguntas frecuentes : P: ¿Para qué tipo de preparación de muestras/construcción de bibliotecas puedo usar el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II para Illumina? R: El kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II para Illumina es compatible con protocolos que requieren un saliente 3' A en las moléculas de la biblioteca para facilitar la ligadura a adaptadores que contienen un saliente 5' T, como la preparación de bibliotecas para secuenciación en la plataforma Illumina. Actualmente, hemos validado el kit de preparación de bibliotecas de ADN Ultra II solo en la plataforma Illumina. P: ¿Qué tipo y cantidad de material de partida necesito para preparar bibliotecas con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II para Illumina? R: Se recomiendan 500 pg -1 ug de ADN fragmentado. P: ¿Es necesario seleccionar el tamaño y cuál es el método recomendado? R: Sí, recomendamos seleccionar el tamaño con perlas SPRIselect o AMPure XP al crear bibliotecas a partir de entradas de ADN > 50 ng. El manual incluye un protocolo detallado de selección de tamaño, con un tamaño de fragmento de ADN que varía de 150 pb a 500-700 pb (tamaño final de la biblioteca: 250-800 pb). El kit Ultra II también es compatible con otros métodos de selección de tamaño, como gel de agarosa y gel E. No se recomienda seleccionar el tamaño si la entrada de ADN es menor o igual a 50 ng. P: ¿Puedo usar el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II para reactivos Illumina para preparar bibliotecas para secuenciación en el Ion Torrent PGM o Proton? R: No. Los adaptadores proporcionados para el Ion Torrent de ThermoFisher tienen extremos romos en lugar de salientes 5'-T. P: ¿Están disponibles estos reactivos en formato personalizado, formato más grande o formatos de 96 pocillos? R: Sí, se pueden adaptar formatos personalizados. Para obtener más información, póngase en contacto con nuestro departamento OEM en custom@neb.com. P: ¿Cómo puedo saber la concentración de mis cebadores índice? R: Para los cebadores índice suministrados en tubos, los últimos cuatro dígitos del número de lote corresponden al año y mes de lanzamiento del kit. Cualquier kit lanzado a partir de diciembre de 2014 (número de lote que termina en 1412) es de 10 µM, y cualquier kit lanzado antes de diciembre de 2014 es de 25 µM. Además, las concentraciones ahora también están impresas en las etiquetas de los tubos. Los cebadores índice incluidos en las placas son de 10 µM. P: ¿Puedo usar este kit NEBNext con adaptadores y cebadores de otros fabricantes? R: Sí, debería ser posible usar adaptadores y cebadores de otros fabricantes con este kit NEBNext. El adaptador debe ser un adaptador con saliente T y el rendimiento final de la biblioteca puede ser ligeramente menor que al usar los adaptadores NEBNext para Illumina®. Las instrucciones de uso con adaptadores con código de barras de longitud completa que no sean NEBNext y con cebadores universales para PCR P5 y P7 se encuentran en los manuales de los adaptadores NEBNext indexados/UMI. Estos manuales se encuentran en neb.com/E7416 (ARN) o neb.com/E7395 (ADN). Seleccione el manual del kit NEBNext que vaya a utilizar. Los manuales están escritos específicamente para los adaptadores NEBNext indexados/UMI; el mismo protocolo debería funcionar con otros adaptadores de diseño similar. Recomendamos realizar un experimento de prueba de principio con el kit de preparación de bibliotecas y los adaptadores indexados deseados, y utilizar muestras desechables para optimizar las condiciones experimentales. P: ¿Qué hago si observo un precipitado en el tampón de reacción de preparación de extremos Ultra II? R: Es frecuente observar un precipitado blanco en el tampón de reparación de extremos Ultra II. Si esto ocurre, deje que la mezcla alcance la temperatura ambiente y pipetee el tampón varias veces para disolver el precipitado, seguido de una agitación rápida en vórtex para mezclar. P: ¿El kit incluye adaptador y cebadores? R: No. El kit se puede utilizar con los oligos multiplex NEBNext para Illumina. Para obtener una lista completa, consulte la Tabla de selección de oligos multiplex NEBNext®. Para usar con los kits de preparación de bibliotecas NEBNext, consulte el manual del kit de preparación de bibliotecas. Los manuales específicos de los kits de oligos multiplex también contienen consejos para configurar las reacciones de PCR. Para conocer las opciones de equilibrio de color, consulte el Selector de oligos de índice NEBNext® para obtener combinaciones de códigos de barras válidas.