New England Biolabs, E7660L, Kit complementario NEBNext® ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies®)

El tamaño pequeño de este producto se discontinuó el 15 de diciembre de 2024. El tamaño grande (NEB n.° E7660L) seguirá estando disponible. Categorías relacionadas Preparación de bibliotecas para Oxford Nanopore Technologies,, Productos NEBNext® ARTIC para secuenciación de SARS-CoV-2,, Preparación de bibliotecas de ARN para Illumina, Materiales de especificación Requeridos pero no suministrados Etanol al 80 % (recién preparado) Tubos DNA LoBind (Eppendorf n.° 022431021) Kits de expansión de códigos de barras nativos de Oxford Nanopore Technologies 1-12 (EXP-NBD104), 13-24 (EXP-NBD114) o 1-96 (EXP-NBD196) Kit de secuenciación por ligadura de Oxford Nanopore Technologies (SQK-LSK109) Kit de expansión SFB de Oxford Nanopore Technologies (EXP-SFB001) Kit de ensayo Qubit® dsDNA HS (ThermoFisher® Q32851) Soporte/gradilla magnética (NEB n.° S1515, Alpaqua®, cat. n.° A001322 o equivalente) Termociclador Mezclador Vortex Microcentrífuga Agilent® Bioanalyzer® o analizador de fragmentos similar y consumibles asociados (sistema TapeStation 4150 o 4200) Tubos de tiras para PCR sin DNasa y ARNasa (USA Scientific 1402-1708) Soporte magnético para tubos de 1,5 ml (NEB n.º S1506) Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre las mezclas de cebadores NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 y las mezclas de cebadores NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 originales? R: Las mezclas de cebadores NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 se han optimizado para mejorar la cobertura de la variante Omicron. En estas mezclas v2, se han reemplazado 10 cebadores, lo que afecta a 7 pares de cebadores. P: ¿Cuál es la diferencia entre las mezclas de cebadores NEBNext VarSkip v2 Short SARS-CoV-2 y las mezclas de cebadores NEBNext ARTIC SARS-CoV-2? R: Las mezclas VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 1 y 2 para la amplificación del genoma del SARS-CoV-2 se basan en secuencias de hCoV-2019/nCoV-2019 versión 3 (v3) con concentraciones de cebadores equilibradas. Las mezclas NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 1 y 2 para la amplificación del genoma del SARS-CoV-2 se diseñaron para reducir el impacto de las variantes en la eficiencia de la amplificación. Los amplicones NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 tienen ~400 pb, mientras que los amplicones NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 tienen ~550 pb. P: ¿Dónde puedo encontrar información sobre la secuencia de cebadores de las mezclas de cebadores NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 y NEBNext ARTIC SARS-CoV-2? R: Las secuencias de cebadores NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 se pueden encontrar aquí: https://github.com/nebiolabs/VarSkip Las secuencias de cebadores NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 se pueden encontrar aquí: https://github.com/joshquick/artic-ncov2019/blob/master/primer_schemes/nCoV-2019/V3/nCoV-2019.tsv P: ¿Se pueden añadir las mezclas de cebadores NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 y NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 a la misma reacción de amplificación dirigida? R: No, las mezclas de cebadores NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 y NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 no se pueden añadir a la misma reacción de amplificación. P: ¿Qué esquema de cebadores debo usar: NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Primer Mixes o NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 Primer Mixes? R: Se recomiendan los NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 Primer Mixes para muestras con variantes conocidas o esperadas del SARS-CoV-2. P: ¿Pueden los NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 Primers cubrir muestras de SARS-CoV-2 no variantes? R: Sí, también se pueden usar para amplificar muestras de SARS-CoV-2 no variantes. P: ¿Qué variantes del SARS-CoV-2 pueden cubrir los NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 Primers? R: Los cebadores VarSkip Short SARS-CoV-2 Short fueron diseñados para ser tolerantes a las variantes. Hemos confirmado que estos cebadores proporcionan una alta cobertura genómica para las siguientes variantes: B.1.351 (Beta) P.1. (Gamma) B1.617.1 (Kappa) B.1.617.2 (Delta) B.1.617.3 BA.1 (Ómicron) BA.2 (Ómicron) P: ¿Se pueden añadir los pares de cebadores de control humano NEBNext ARTIC y las mezclas de cebadores NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 a la misma reacción de amplificación dirigida? R: Sí, los pares de cebadores de control humano NEBNext ARTIC 1 y 2 son controles internos opcionales. Si se utilizan, se deben combinar los pares de cebadores de control humano NEBNext ARTIC y la mezcla de cebadores NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 adecuados antes de su uso. Los pares de cebadores de control humano 1 se pueden combinar con la mezcla de cebadores 1 de NEBNext ARTIC NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 y los pares de cebadores de control humano 2 se pueden combinar con la mezcla de cebadores 2 de NEBNext ARTIC NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2. Los pares de cebadores de control humano NEBNext ARTIC generan amplicones de 400 pb, mientras que los amplicones de VarSkip Short v2 son de ~550 pb. Tras la fragmentación enzimática, los tamaños de los fragmentos de control humano y VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 son ambos de ~120 pb. P: ¿Cómo analizo los datos de secuenciación de VarSkip Short v2 SARS-CoV-2? R: Los datos de secuenciación de VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 se pueden analizar utilizando los mismos métodos de análisis que la secuenciación de amplicones multiplex ARTIC. Todos los archivos de referencia necesarios para modificar los procesos de análisis de secuenciación de ARTIC para el análisis de secuenciación VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 se pueden encontrar en https://github.com/nebiolabs/VarSkip. P: ¿Son las secuencias de los cebadores en las mezclas de cebadores NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 las mismas que las de los cebadores ARTIC Network V3? R: Sí, las secuencias son las mismas y se pueden encontrar aquí. Los cebadores en las mezclas de cebadores NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 se han equilibrado, utilizando la metodología desarrollada en NEB basada en datos empíricos de secuenciación, para producir una cobertura más uniforme en todo el genoma. P: ¿Qué valores de Ct se recomiendan para las entradas utilizadas con el kit complementario NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies)? R: De acuerdo con las directrices de ARTIC Network, la entrada de ARN viral de muestras clínicas debe estar entre Ct 18-35. Si el Ct está entre 12 y 15, se recomienda diluir la muestra 100 veces en agua. Si el Ct está entre 15 y 18, se recomienda una dilución 10 veces en agua. Esto reducirá la probabilidad de inhibición de la PCR. P: Si utilizo 96 muestras, ¿puedo omitir el paso de limpieza después de la amplificación de ADNc dirigida? R: Para un gran número de muestras, se puede omitir el paso de limpieza después de la amplificación de ADNc dirigida (sección 2.5 del manual) y las muestras de ADNc se pueden utilizar directamente para la preparación final de NEBNext (sección 4.1). Esto es coherente con el protocolo de secuenciación ARTIC Network nCoV-2019 v3 (LoCost). P: ¿Cuántos datos necesito para secuenciar bibliotecas generadas con el kit complementario NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies)? R: En pruebas con muestras de ARN sintético o inactivado por calor del SARS-CoV-2 con Ct 30 o aproximadamente 1000 copias de ARNg, se logró el ensamblaje completo del genoma (>90 % para el ARN sintético y >99 % para el ARN de COVID-19 inactivado por calor) utilizando datos de cobertura de 250x o 24 500 lecturas. P: ¿Cómo analizo mis datos de las bibliotecas de secuenciación generadas con el kit complementario NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies)? R: Se recomienda utilizar ARTIC-nCoV-bioinformaticsSOP-v1.1 de ARTIC Network. El flujo de trabajo RAMPART también puede utilizarse para la asignación de lecturas, el mapeo y el análisis filogenético en tiempo real. P: ¿Qué kits de Oxford Nanopore Technologies necesito para el flujo de trabajo completo? R: Necesitará los siguientes kits: Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109) o Oxford Nanopore Technologies Adapter Mix II Expansion (EXP-AMII001), kit de cebado de celda de flujo (EXP-FLP002) y viales auxiliares de secuenciación (EXP-AUX001), Oxford Nanopore Technologies SFB Expansion Kit (EXP-SFB001), Oxford Nanopore Technologies Native Barcoding Expansion Kits 1-12 (EXP-NBD104), 13-24 (EXP-NBD114) o 1-96 (EXP-NBD196). P: ¿El NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit (Oxford Nanopore Technologies) es compatible con el protocolo de secuenciación ARTIC Network nCoV-2019 v3 (LoCost) o con el protocolo Oxford Nanopore Technologies Eco PCR Tiling? R: Este kit es ampliamente compatible con estos protocolos. Sin embargo, es esencial seguir el protocolo NEBNext ARTIC RT-PCR para lograr una amplificación óptima del amplicón con el conjunto de cebadores balanceados. Tenga en cuenta que será necesaria la compra de la mezcla maestra Q5 Hot Start High-Fidelity 2x adicional (NEB n.° M0494) si se siguen estos protocolos. P: ¿Hay consejos para evitar la contaminación cruzada de códigos de barras? R: Para evitar la contaminación cruzada de códigos de barras o la falta de coincidencia durante la llamada de bases, se recomienda ejecutar guppy de nuevo para ordenar las lecturas con 5′ y 3′ ligados con los mismos códigos de barras. Oxford Nanopore Technologies proporciona información adicional sobre el uso de guppy con la opción de lecturas de llamada de bases con códigos de barras duales. P: ¿Es el kit complementario NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies) compatible con todos los instrumentos ONT? R: Las bibliotecas generadas con este kit se pueden ejecutar en cualquier plataforma de Oxford Nanopore Technologies. Se recomiendan MinION y GridION para esta aplicación. P: ¿El kit NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit (Oxford Nanopore Technologies) incluye suficientes microesferas para todo el flujo de trabajo de preparación de la biblioteca ARTIC? R: E7660 incluye suficientes microesferas para todo el flujo de trabajo, incluidas las partes del flujo de trabajo que utilizan kits de Oxford Nanopore Technologies. El único reactivo necesario que no se proporciona en el kit es etanol al 80%. P: ¿Hay pasos que pueda seguir si el número de ocupación de poros es bajo al realizar la secuenciación? R: Los siguientes enfoques pueden ser útiles: Para garantizar una buena ocupación de poros, se deben cargar 20 ng de ADN de la biblioteca para la secuenciación en MinION y GridION. Algunos contaminantes remanentes de muestras de ARN extraídas o reactivos de preparación de bibliotecas pueden afectar negativamente la ocupación de poros. Para resolver este problema, se puede realizar un lavado de 2 x 1 ml con etanol al 80 % en el paso 1.6.19 en lugar de 1 x 500 µl de etanol al 80 %. Además, se puede preparar un ADN de biblioteca más limpio realizando un lavado SFB adicional de 250 µl en el paso 1.8.8, para un total de 3 lavados SFB de 250 µl. P: ¿Puedo usar menos adaptador de código de barras nativo durante el paso de ligadura (1.5.1)? R: Si planea ejecutar una gran cantidad de muestras, por ejemplo, un total de 48 muestras por ejecución de secuenciación, puede reducir el volumen de reacción en el paso 1.5.1 a la mitad y también reducir el volumen de cada componente en esa reacción a la mitad. Sin embargo, si está ejecutando 24 muestras o menos, le recomendamos seguir nuestro protocolo estándar. P: ¿Cómo se puede aumentar el porcentaje de lecturas con código de barras doble? R: Las lecturas con código de barras doble son lecturas con el adaptador de secuenciación en ambos extremos. Para aumentar el porcentaje de lecturas con doble código de barras, los amplicones de RT-PCR se pueden diluir 3 veces y se puede usar 1 µl de los amplicones diluidos en el paso 1.4.1 de NEBNext End Prep. Esto reducirá la cantidad de ADN introducido y el rendimiento final de los datos de cada muestra, pero mejorará la eficiencia de End Prep y dará como resultado un mayor porcentaje de lecturas con doble código de barras. Recomendamos realizar esta dilución de amplicones cuando se utilicen 48 muestras o más. P: ¿Qué sucede si no tengo suficientes muestras para generar suficiente ADN de la biblioteca para la secuenciación? R: Se pueden realizar dos o más reacciones de código de barras (paso 1.4.1) por muestra de amplicón. Recomendamos usar el mismo código de barras si las reacciones provienen de la misma muestra para facilitar el análisis posterior de los datos. P: Para muestras con un Ct alto, ¿cómo se puede aumentar el rendimiento de los datos? R: Para muestras con un valor de Ct de 30 o superior, los fallos de secuenciación pueden aumentar. Para muestras con un Ct tan alto, se pueden realizar dos o más reacciones de codificación de barras (paso 1.4.1) para cada amplicón de PCR, a fin de aumentar el rendimiento de los datos. Recomendamos usar el mismo código de barras si las reacciones provienen de la misma muestra, para facilitar el análisis posterior de los datos. P: ¿Es necesario que mi muestra de ARN total esté libre de ADN antes de iniciar el flujo de trabajo ARTIC? R: No, el ARN no necesita estar libre de ADN para el flujo de trabajo ARTIC. P: ¿Es el kit complementario NEBNext® ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies®) E7660 compatible con el kit de codificación de barras nativo Oxford Nanopore V14 (SQK-NBD114)? R: Sí, es compatible. Recomendamos seguir el protocolo del kit complementario NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies) E7660 como antes y no el protocolo SQK-NBD114, incluida la concentración de carga. P: ¿Se puede mejorar la cobertura para las variantes recientes? R: Sí, los cebadores de adición se han diseñado y probado para abordar las áreas de baja cobertura causadas por las variantes KP y JN. Estos cebadores se pueden proporcionar gratuitamente si se solicitan. Por favor, contacte con info@neb.com. Como alternativa, puede utilizar las secuencias a continuación para la síntesis de cebadores personalizados con su proveedor de oligonucleótidos preferido. Estos cebadores de adición deben utilizarse con los cebadores VarSkip Short v2 siguiendo los protocolos que se indican a continuación. Concentración objetivo de la secuencia del cebador de mezcla de adición VSSv2f en 1xPool (µM) 1 varskip-0317-1_1_LEFT_ALT3 ATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACG 0.5 1 varskip-0317-1_05_RIGHT_ALT2 GACAATTTCACAAGCACAGGTTGAG 0.5 1 varskip-0317-1_07_LEFT_ALT2 CCTCTAAAAGCCCCAAAAGAAATTATC 0.5 1 varskip-0317-1_09_RIGHT_ALT2 GTTTACTTTCAGTTATAAATGGCTTAACTTC 0.5 1 varskip-0317-1_11_LEFT_ALT2 GTGGCACTACTGAAATGCTAGC 0.5 1 varskip-0317-1_13_RIGHT_ALT2 TTCATAAGAAAGTGTGCCCATGTAC 0.5 1 varskip-0317-1_15_RIGHT_ALT1 GTCCAAAGACAACGTATACACC 0.5 1 varskip-0317-1_35_LEFT_ALT2 GATGATTATTTCAATAAAAAGGACTGGTATG 0.5 1 varskip-0317-1_45_RIGHT_ALT2 ATTGATCTCCAGGCGGTGGTTT 0.5 1 49_R_ALT2 GTAATAAGAACACCATTACGGGCAT 0.5 1 varskip-0317-1_53_RIGHT_ALT2 TGAGGATCTGAAAACTTTGTCAGG 0.5 1 55_L_ALT1 CCTACTTATTGTTAATAACGCTAACTAATGTT 0.5 1 varskip-0317-1_57_ALT_IZQUIERDA6 CTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGA 0.5 2 varskip-0317-1_24_ALT_IZQUIERDA2 GCCTTTAATACTTTACTATTCCTTATGTC 0.5 2 varskip-0317-1_28_ALT_DERECHA2 AGGCCAAAGTAACAAGTACAAAAATAGC 0.5 2 varskip-0317-1_32_ALT_DERECHA2 CTGTTATTGCCTGACCAGTACC 0.5 2 varskip-0317-1_34_ALT_DERECHA2 ATCACAGAATTGTACTGTTTTTAACAAAGC 0.5 2 varskip-0317-1_54_ALT_DERECHA2 CTTCAAGGTCCATAAGAAAAGGCT 0.5 2 56L_ALT1 TTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGG 0.5 2 varskip-0317-1_56_RIGHT_ALT2 CAGCCTGTAAAATCATCTGGTAATTTAT 0.5 Protocolos para el uso de cebadores de adición: Para kits de 96 reacciones: Descongele la mezcla de adición 1 de VSSv2f, la mezcla de adición 2 de VSSv2f, la mezcla de cebadores 1 de VSSv2 y la mezcla de cebadores 2 de VSSv2. Mezcle y centrifugue rápidamente los cuatro tubos. Añada 3 μl de la mezcla de adición 1 de VSSv2f a la mezcla de cebadores 1 de VSSv2, agite en vórtex, centrifugue y coloque en hielo. Añada 2,5 μl de la mezcla de adición 2 de VSSv2f a la mezcla de cebadores 2 de VSSv2, agite en vórtex, centrifugue y coloque en hielo. Utilice la mezcla de cebadores VarSkip Short v2 1 y 2 enriquecida para el protocolo de RT-PCR. Para kits de 24 reacciones: Descongele la mezcla de adición 1 de VSSv2f, la mezcla de adición 2 de VSSv2f, la mezcla de cebador 1 de VSSv2 y la mezcla de cebador 2 de VSSv2. Mezcle y centrifugue rápidamente los cuatro tubos. Añada 2 μl de la mezcla de adición 1 de VSSv2f a 2 μl de TE 0,1x para diluir a la mitad la mezcla de adición 1 de VSSv2f. Añada 1,5 μl de la mezcla de adición 1 de VSSv2f diluida a la mezcla de cebador 1 de VSSv2, agite en vórtex, centrifugue y coloque en hielo. Añada 2 μl de la mezcla de adición 2 de VSSv2f a 2 μl de TE 0,1x para diluir a la mitad. Añada 1,25 μl de la mezcla de adición 2 de VSSv2f diluida a la mezcla de cebadores 2 de VSSv2, agite en vórtex, centrifugue y coloque en hielo. Utilice las mezclas de cebadores 1 y 2 de VarSkip Short v2 enriquecidas para el protocolo de RT-PCR.