New England Biolabs, E7750X, NEBNext® Kit de depleción de globina y ARNr (humano/ratón/rata)

El ARNm y ARNr de globina son muy abundantes en muestras de sangre, y su eliminación eficiente y específica es deseable para revelar la importancia biológica de las transcripciones menos abundantes. Categorías relacionadas Depleción de ARN y enriquecimiento de ARNm, Análisis del epitranscriptoma, Preparación de bibliotecas de ARN para Illumina Materiales de especificación necesarios pero no suministrados Gradilla/soporte magnético como la gradilla de separación magnética NEBNext (NEB n.º S1515) Etanol al 80 % (recién preparado) Termociclador Tubos de PCR de pared delgada de 200 μl Bioanalyzer®, TapeStation® (Agilent Technologies, Inc.) o analizador de fragmentos similar y consumibles Perlas Agencourt® RNAClean® XP (Beckman Coulter, Inc. n.º A63987) Preguntas frecuentes P: ¿Para qué especies puedo usar el kit de depleción de ARNm y ARNr de globina NEBNext®? ¿Funcionará para otras especies? R: El kit depleta el ARNm y el ARNr de globina del ARN total de humanos, ratones y ratas. Puede funcionar en otras especies siempre que las secuencias de ARNr y ARNm de globina sean similares a las de humanos, ratones y ratas. P: ¿Qué ARNm y ARNr de globina se depletan con el kit de depleción de ARNm y ARNr de globina NEBNext® (humanos, ratones y ratas)? R: El kit depleta el ARNm de globina adulta, fetal y embrionaria (HBA 1/2, HBB, HBD, HBM, HBG1/2, HBE, HBQ1 y HBZ). También se depleta el ARNr citoplasmático (5S, 5.8S, 18S, 28S, ITS y ETS) y mitocondrial (12S y 16S). P: ¿Puedo usar el NEBNext® Globin mRNA & rRNA Depletion Kit (Humano/Ratón/Rata) con ARN degradado o ARN fragmentado? R: Sí, este kit se puede usar con ARN degradado o fragmentado. P: ¿Cuál es la entrada total de ARN que debo usar? R: El kit ha sido optimizado para una entrada de ARN total de 10-1,000 ng (100 ng mínimo para ARN fragmentado o degradado). Para RNA-seq, recomendamos usar entradas superiores a 100 ng para aumentar la complejidad de la biblioteca y reducir la tasa de duplicación. P: ¿Por qué el ARN debe estar libre de ADN? R: El ADN contaminante puede causar una cuantificación inexacta del ARN e impedir la eliminación adecuada del ARNm y ARNr de globina. P: ¿Cuál es el rendimiento de ARN esperado recuperado después del agotamiento del ARNm y ARNr de globina? R: El porcentaje de ARN aislado después del agotamiento de globina y ARNr variará entre diferentes muestras de ARN. Normalmente, se recupera entre el 1 % y el 3 % del ARN de entrada. P: ¿Cuál es el porcentaje de ARNm y ARNr de globina que queda tras la depleción? R: El porcentaje de ARNm y ARNr de globina que queda tras la depleción varía según la especie. Normalmente, queda menos del 1 % de ARNm de globina y entre el 1 % (humano) y el 5 % (ratón/rata) de ARNr. P: ¿Cómo puedo determinar si la depleción del ARNm y ARNr de globina fue eficiente? R: Para evaluar la eficiencia de la depleción, diseñe cebadores de RT qPCR para el ARNm y el ARNr de globina de la especie de muestra, y cebadores para un gen constitutivo. Compare el contenido de ARNm y ARNr de globina antes y después de la depleción. P: Solo me interesa el ARN codificante. ¿Puedo usar el kit de depleción de ARNm y ARNr de globina NEBNext® (humano/ratón/rata) para eliminar el ARNm de globina del ARNm previamente enriquecido? R: Sí. El kit se puede utilizar después del enriquecimiento de ARNm de poli (A) (p. ej., utilizando el módulo de aislamiento magnético de ARNm de poli (A) NEBNext, NEB n.º E7490), de modo que el ARN agotado final contenga solo ARNm de interés y no ARN no codificante. P: ¿Funciona el kit de depleción de ARNm y ARNr de globina NEBNext® (humano/ratón/rata) para aplicaciones de perfilado o huella ribosómica? R: El protocolo proporcionado con este kit no ha sido validado para perfilado o huella ribosómica. P: ¿Puedo utilizar las perlas magnéticas Agencourt® AMPure® XP en lugar de las perlas de purificación de muestras de ARN NEBNext® (perlas magnéticas RNAClean® XP)? R: Sí, es posible utilizar perlas AMPure XP. Sin embargo, recomendamos utilizar las perlas RNAClean XP/perlas de purificación de muestras de ARN NEBNext® (suministradas en NEB n.º E7755), ya que estas perlas se han fabricado y probado para eliminar la contaminación por ARNasa. Una versión del kit incluye estas microesferas: NEBNext® Globin mRNA and rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) con microesferas de purificación de muestras de ARN (NEB n.° E7755). P: ¿Puedo utilizar otros métodos de purificación además de las microesferas de purificación de muestras de ARN NEBNext® o las microesferas magnéticas Agencourt® RNAClean® XP? R: Aunque recomendamos utilizar las microesferas RNAClean® XP (suministradas en NEB n.° E7755), las muestras con microesferas de purificación de muestras de ARN NEBNext® también pueden purificarse mediante precipitación con etanol o con limpiadores de columnas de ARN como el kit de limpieza de ARN Monarch Spin (NEB n.° T2030). Para usar con otras columnas, consulte las especificaciones de la columna para conocer el rango de tamaño del ARN y garantizar que se conserve cualquier ARN fragmentado durante la limpieza. P: ¿Se puede utilizar el ARN enriquecido resultante del kit de depleción NEBNext en aplicaciones de secuenciación de lectura larga? R: Sí, pero tenga en cuenta que el ARN se fragmenta ligeramente durante el proceso de depleción. Esto puede reducir la longitud de lectura. P: ¿Puedo usar el kit de preparación de biblioteca de ARN NEBNext UltraExpress® con el kit de depleción de globina y ARNr NEBNext® (humano/ratón/rata) o el juego de reactivos de depleción de ARN NEBNext®? R: Es posible usar el kit de preparación de biblioteca de ARN NEBNext UltraExpress con el kit de depleción de globina y ARNr NEBNext (humano/ratón/rata) o el juego de reactivos de depleción de ARN NEBNext; sin embargo, no existe un protocolo oficial. Para obtener instrucciones, póngase en contacto con el soporte técnico de NEB en info@neb.com.