New England Biolabs, E7760S, Kit de preparación de biblioteca de ARN direccional NEBNext® Ultra™ II para Illumina®

Para usar junto con este kit, el módulo de aislamiento magnético de ARNm NEBNext Poly(A) ( Categorías relacionadas Automatización para la preparación de bibliotecas NGS NEBNext®, Preparación de bibliotecas de ARN para Illumina, Aplicaciones de preparación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación Aplicaciones de enzimas USER® y termolábiles USER II Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Oligonucleótidos NEBNext singleplex o multiplex para Illumina (NEB.com/oligos) u oligonucleótidos suministrados por el cliente Gradilla o placa magnética (p. ej., Gradilla de separación magnética NEBNext® (NEB n.º S1515S), Placa supermagnética Alpaqua ® 96S (n.º A001322) o equivalente) Kit de reactivos SPRIselect® (Beckman Coulter, Inc. n.º B23317) o perlas AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. n.º A63881) Etanol al 80 % (recién preparado) Termociclador NEBNext Poly(A) Módulo de aislamiento magnético de ARNm (NEB n.° E7490) o NEBNext® rRNA Depletion Kit v2 (humano/ratón/rata) (NEB n.° E7400 o NEB n.° E7405) o NEBNext® Globin & rRNA Depletion Kit (humano/ratón/rata) (NEB n.° E7750 o NEB n.° E7755) o NEBNext® rRNA Depletion Kit (bacterias) (NEB n.° E7850 o NEB n.° E7860) o NEBNext® RNA Depletion Core Reagent Set (NEB n.° E7865 o NEB n.° E7870) o NEBNext rRNA Depletion Kit (humano/ratón/rata) (NEB n.° E6310 o NEB n.° E6350) Preguntas frecuentes P: Tengo la enzima USER de mi kit de preparación de biblioteca (tapa azul) y la enzima USER de mi Kit de cebadores de índice NEBNext (tapa roja). ¿Son iguales? R: Sí, son iguales. Incluimos USER en los kits de ARN direccional NEBNext Ultra, ya que es necesario para el flujo de trabajo (tapa azul). La enzima USER con tapa roja se incluye en nuestros kits de oligonucleótidos para su uso con el adaptador NEBNext. Si utiliza el kit de preparación de biblioteca de ARN direccional NEBNext Ultra I o Ultra II con el adaptador NEBNext, solo se requiere un paso de USER y se puede usar cualquiera de los viales de la enzima USER proporcionados. P: ¿Cuál es la diferencia entre el kit de preparación de biblioteca de ARN direccional NEBNext Ultra II (NEB n.° E7760) y el kit de preparación de biblioteca de ARN NEBNext Ultra II (NEB n.° E7770)? R: El flujo de trabajo de preparación de biblioteca de ARN direccional NEBNext Ultra II conserva la información sobre la orientación de la cadena de ARN, mientras que el de preparación de biblioteca de ARN NEBNext Ultra II no lo hace. El de preparación de biblioteca de ARN direccional NEBNext Ultra II contiene dUTP en la segunda cadena. Tampón de síntesis que permite el marcaje del ADNc de segunda cadena y su posterior escisión con la enzima USER. El kit de preparación de bibliotecas de ARN direccional NEBNext Ultra II también contiene reactivo de especificidad de cadena para mejorar aún más la direccionalidad. P: ¿Cuál es la diferencia entre el kit de preparación de bibliotecas de ARN direccional NEBNext Ultra II (NEB n.° E7760) y el kit original de preparación de bibliotecas de ARN direccional NEBNext Ultra (NEB n.° E7420)? R: Se ha optimizado cada paso del flujo de trabajo del kit de preparación de bibliotecas de ARN direccional NEBNext Ultra II, incluyendo la incorporación de varios reactivos nuevos. Esto permite utilizar cantidades de entrada de 10 a 20 veces menores y menos ciclos de PCR en comparación con el kit original, lo que resulta en un rendimiento de bibliotecas sustancialmente mayor, sin comprometer la calidad de la biblioteca. Ahora también se incluye el reactivo de especificidad de cadena. P: ¿Cuál es el material de partida que necesito para preparar bibliotecas con el kit de ARN direccional NEBNext Ultra II? R: El material de partida es ARN total. (10 ng-1 μg); ARNm previamente aislado (1-100 ng) o ARN con depleción ribosómica (1-100 ng). P: ¿Qué kit puedo usar para aislar ARNm poli(A) del ARN total? R: Para aislar ARNm poli(A) del ARN total, utilice el módulo de aislamiento magnético de ARNm poli(A) NEBNext (NEB n.° E7490). P: ¿Qué kit puedo usar para deplecionar el ARN ribosómico (ARNr) del ARN humano, de ratón o de rata? R: Para deplecionar el ARNr de humanos, ratones o ratas, utilice el kit de depleción de ARNr NEBNext v2 (humano/ratón/rata) (NEB n.° 7400). P: ¿Puedo usar este kit NEBNext con adaptadores y cebadores de otros fabricantes? R: Sí, debería ser posible usar adaptadores y cebadores de otros fabricantes con este kit NEBNext. El adaptador debe ser un T. El adaptador de voladizo y el rendimiento final de la biblioteca pueden ser ligeramente inferiores a los que se obtienen con los adaptadores NEBNext para Illumina®. Las instrucciones de uso con adaptadores con código de barras de longitud completa que no sean NEBNext y los cebadores universales de PCR P5 y P7 se encuentran en los manuales de los adaptadores NEBNext indexados/UMI. Estos manuales se encuentran en neb.com/E7416 (ARN) o neb.com/E7395 (ADN). Elija el manual del kit NEBNext que vaya a utilizar. Los manuales están escritos específicamente para los adaptadores NEBNext indexados/UMI; el mismo protocolo debería funcionar con otros adaptadores de diseño similar. Recomendamos realizar un experimento de prueba de principio con el kit de preparación de bibliotecas y los adaptadores indexados deseados, y utilizar muestras descartables para optimizar las condiciones experimentales. P: ¿Qué hago si veo un precipitado en el tampón de reacción de preparación de extremos Ultra II? R: No es raro ver un precipitado blanco en el tampón de reparación de extremos Ultra II. Si esto ocurre, espere Deje que la mezcla alcance la temperatura ambiente y pipetee el tampón varias veces para disolver el precipitado, seguido de un vórtex rápido para mezclar. P: ¿Es posible reducir el volumen de las microesferas añadidas durante el paso de limpieza de la síntesis de la segunda cadena? R: El volumen total de la muestra cuando se añaden microesferas durante el paso de limpieza de la síntesis de la segunda cadena es de 224 µl, lo que puede superar el volumen de algunos tubos y placas de PCR de 0,2 ml. Además, este volumen puede no permitir la separación completa de las microesferas utilizando algunos imanes. Muchas placas y tubos de PCR con un valor nominal de 0,2 ml tienen una capacidad real mayor que admite una muestra de 224 µl. Sin embargo, si la placa o el tubo que prefiere utilizar no admite un volumen de muestra de 224 µl, es posible reducir el volumen de las microesferas a 1,5 x (120 µl) para un volumen total de líquido de solo 200 µl. En nuestro caso, no observamos una reducción en el rendimiento final de la biblioteca. P: ¿Cuál es la composición de ¿Los cebadores aleatorios? R: Los cebadores aleatorios son hexámeros aleatorios suministrados a 1,9 mM. P: ¿El kit incluye adaptador y cebadores? R: No. El kit se puede usar con los oligos multiplex NEBNext para Illumina. Para obtener una lista completa, consulte la Tabla de selección de oligos multiplex NEBNext®. Para usar con los kits de preparación de bibliotecas NEBNext, consulte el manual del kit de preparación de bibliotecas. Los manuales específicos de los kits de oligos multiplex también contienen consejos para configurar las reacciones de PCR. Para conocer las opciones de equilibrio de color, consulte el Selector de oligos de índice NEBNext® para ver las combinaciones de códigos de barras válidas. P: ¿Es posible reducir el volumen de microesferas añadidas durante el paso de limpieza de la síntesis de la segunda cadena del protocolo para E7760, E7765, E7770 y E7775? R: El volumen total de la muestra cuando se añaden microesferas durante el paso de limpieza de la síntesis de la segunda cadena es de 224 µl, lo que puede superar el volumen de algunos tubos y placas de PCR de 0,2 ml. En Además, este volumen podría no permitir la separación completa de las microesferas con algunos tipos de imanes. Muchas placas y tubos de PCR con un valor nominal de 0,2 ml tienen una capacidad real mayor, que admite una muestra de 224 µl. Sin embargo, si la placa o el tubo que prefiere utilizar no admite un volumen de muestra de 224 µl, es posible reducir el volumen de las microesferas a 1,5 x (120 µl) para un volumen total de líquido de solo 200 µl.