New England Biolabs, E7770L, Kit de preparación de biblioteca de ARN NEBNext® Ultra™ II para Illumina®

¿Prefiere usar métodos de preparación de bibliotecas no específicas de cadena, pero necesita mayor sensibilidad y especificidad en sus experimentos de secuenciación de ARN, con cantidades cada vez menores de ARN de entrada? Para abordar estos desafíos, nuestro kit de preparación de bibliotecas de ARN no direccional de nueva generación se ha reformulado en cada paso, lo que resulta en rendimientos mucho mayores de bibliotecas de alta calidad y permite el uso de menores cantidades de entrada y menos ciclos de PCR. Categorías relacionadas Preparación de bibliotecas de ARN para Illumina Materiales de especificación necesarios pero no suministrados Oligonucleótidos NEBNext Singleplex o Multiplex para Illumina (NEB.com/oligos) u oligonucleótidos suministrados por el cliente Gradilla o placa magnética (p. ej., Gradilla de separación magnética NEBNext® (NEB n.° S1515S), Placa supermagnética Alpaqua ® 96S (n.° A001322) o equivalente) Etanol al 80 % (recién preparado) Termociclador Módulo de aislamiento magnético de ARNm de poli(A) NEBNext (NEB n.° E7490) o Kit de depleción de ARNr NEBNext® v2 (humano/ratón/rata) (NEB n.° E7400 o NEB n.° E7405) o Kit de depleción de globina y ARNr NEBNext® (humano/ratón/rata) (NEB n.° E7750 o NEB n.° E7755) o Kit de depleción de ARNr NEBNext® Preguntas frecuentes sobre el kit de depleción (bacterias) (NEB n.° E7850 o NEB n.° E7860) o el kit de depleción de ARN NEBNext® (NEB n.° E7865 o NEB n.° E7870) o el kit de depleción de ARNr NEBNext (humano/ratón/rata) (NEB n.° E6310 o NEB n.° E6350) . P : ¿El kit incluye adaptador y cebadores? R: No. El kit se puede usar con los oligos multiplex NEBNext para Illumina. Para obtener una lista completa, consulte la tabla de selección de oligos multiplex NEBNext®. Para usar con los kits de preparación de bibliotecas NEBNext, consulte el manual del kit de preparación de bibliotecas. Los manuales específicos de los kits de oligos multiplex también incluyen consejos para configurar las reacciones de PCR. Para obtener información sobre las opciones de balance de color, consulte el selector de oligos de índice NEBNext® para obtener combinaciones de códigos de barras válidas. P: ¿Es compatible el kit Monarch® Total RNA Miniprep con los reactivos NEBNext® para la preparación de bibliotecas de ARN? R: Sí. El ARN purificado con este kit puede utilizarse para la preparación de bibliotecas de ARN utilizando los reactivos NEBNext RNA Library Prep de NEB. El ARN purificado con Monarch puede utilizarse para preparar bibliotecas de ARN-seq de alta calidad para el análisis de la expresión génica. Los niveles de transcripción en el ARN de referencia humano universal (UHRR, Agilent) se comparan antes y después de la repurificación utilizando Qiagen RNeasy® o el kit Monarch Total RNA Miniprep. Se observa una fuerte correlación con el UHRR sin tratar para ambos métodos (R de Pearson > 0,99 para ambas muestras). Todas las muestras presentan una cobertura constante de transcripción de extremo a extremo, lo que indica la ausencia de degradación detectable durante la purificación. El ARN seleccionado con poli-A se seleccionó de 100 ng de muestras sin tratar de Qiagen y Monarch utilizando el módulo de aislamiento magnético de ARNm de poli(A) NEBNext (NEB n.° E7490). Se prepararon bibliotecas de ARN-seq con el kit de preparación de bibliotecas de ARN direccional NEBNext Ultra II para Illumina® (NEB n.° E7760) antes de secuenciarlas en un instrumento Miseq® (2 x 150). Se extrajeron aleatoriamente 1,6 millones de lecturas de cada biblioteca y se recortó el adaptador (Seqprep v1.1). Los niveles de todos los transcritos de Gencode v26 se evaluaron con Salmon (0,4) y se graficaron arriba (panel A). La cobertura promedio 5'-3' de los transcritos de Gencode v26 (evaluada con CollectRnaSeqMetrics 1.56 de Picard tras mapear el genoma de referencia GRCh38 con Hisat v2.0.3 y marcar los duplicados con MarkDuplicates 1.56 de Picard) se muestra a continuación (panel B). P: ¿Puedo usar este kit NEBNext con adaptadores y primers de otros proveedores que no sean NEB? R: Sí, debería ser posible usar adaptadores y cebadores de otros proveedores con este kit NEBNext. El adaptador debe ser un adaptador con saliente T y el rendimiento final de la biblioteca puede ser ligeramente menor que al usar los adaptadores NEBNext para Illumina®. Las instrucciones de uso con adaptadores con código de barras de longitud completa que no sean NEBNext y los cebadores universales para PCR P5 y P7 se encuentran en los manuales de los adaptadores NEBNext indexados/UMI. Estos manuales se encuentran en neb.com/E7416 (ARN) o neb.com/E7395 (ADN). Seleccione el manual del kit NEBNext que vaya a utilizar. Los manuales están escritos específicamente para los adaptadores NEBNext indexados/UMI; el mismo protocolo debería funcionar con otros adaptadores de diseño similar. Recomendamos realizar un experimento de prueba de principio con el kit de preparación de bibliotecas y los adaptadores indexados deseados, y utilizar muestras fungibles para optimizar las condiciones experimentales. P: ¿Qué kit puedo usar para aislar el ARNm poli(A) del ARN total? R: Para aislar el ARNm poli(A) del ARN total, utilice el módulo de aislamiento magnético de ARNm poli(A) NEBNext (NEB n.° E7490). P: ¿Es posible reducir el volumen de microesferas añadidas durante el paso de limpieza de la síntesis de la segunda cadena del protocolo para E7760, E7765, E7770 y E7775? R: El volumen total de la muestra al añadir microesferas durante el paso de limpieza de la síntesis de la segunda cadena es de 224 µl, lo que puede superar el volumen de algunos tubos y placas de PCR de 0,2 ml. Además, este volumen puede no permitir la separación completa de las microesferas con algunos tipos de imán. Muchas placas y tubos de PCR con un valor nominal de 0,2 ml tienen una capacidad real mayor, que admite una muestra de 224 µl. Sin embargo, si la placa o el tubo que prefiere usar no admite un volumen de muestra de 224 µl, es posible reducir el volumen de las microesferas a 1,5 x (120 µl) para un volumen total de líquido de solo 200 µl. P: ¿Cuál es el material de partida que necesito usar al preparar bibliotecas con el kit NEBNext Ultra II Directional RNA? R: El material de partida es ARN total (10 ng-1 μg); ARNm previamente aislado (1-100 ng) o ARN con depleción ribosómica (1-100 ng). P: ¿Qué kit puedo usar para deplecionar el ARN ribosómico (ARNr) del ARN humano, de ratón o de rata? R: Para deplecionar el ARNr de humanos, ratones o ratas, utilice el kit NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (Humano/Ratón/Rata) (NEB n.º 7400). P: ¿Cuál es la diferencia entre el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext Ultra II (NEB n.° E7770) y el kit original de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext Ultra (NEB n.° E7530)? R: Se ha optimizado cada paso del flujo de trabajo del kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext Ultra II, incluyendo la incorporación de varios reactivos nuevos. Esto permite usar cantidades de entrada de 10 a 20 veces menores y menos ciclos de PCR en comparación con el kit original, lo que resulta en rendimientos de bibliotecas sustancialmente mayores, sin comprometer la calidad de la biblioteca. P: ¿Es posible reducir el volumen de microesferas añadidas durante el paso de limpieza de la síntesis de la segunda cadena? R: El volumen total de la muestra cuando se añaden microesferas durante el paso de limpieza de la síntesis de la segunda cadena es de 224 µl, lo que puede superar el volumen de algunos tubos y placas de PCR de 0,2 ml. Además, este volumen puede no permitir la separación completa de las microesferas con algunos imanes. Muchas placas y tubos de PCR con un valor nominal de 0,2 ml tienen una capacidad real mayor, que admite una muestra de 224 µl. Sin embargo, si la placa o el tubo que prefiere usar no admite un volumen de muestra de 224 µl, es posible reducir el volumen de las microesferas a 1,5 x (120 µl) para un volumen total de líquido de solo 200 µl. En nuestras manos, no observamos una reducción en el rendimiento final de la biblioteca. P: ¿Qué hago si veo un precipitado en el tampón de reacción de preparación de extremos Ultra II? R: No es raro ver un precipitado blanco en el tampón de reparación de extremos Ultra II. Si esto ocurre, deje que la mezcla alcance la temperatura ambiente y pipetee el tampón varias veces para disolver el precipitado, seguido de un vórtex rápido para mezclar.