New England Biolabs, E7775L, preparación de biblioteca de ARN NEBNext® Ultra™ II con perlas de purificación de muestras

Categorías relacionadas Preparación de bibliotecas de ARN para Illumina Materiales de especificación necesarios pero no suministrados Oligonucleótidos NEBNext Singleplex o Multiplex para Illumina (NEB.com/oligos) u oligonucleótidos suministrados por el cliente Gradilla o placa magnética (p. ej., Gradilla de separación magnética NEBNext® (NEB n.° S1515S), Placa supermagnética Alpaqua ® 96S (n.° A001322) o equivalente) Etanol al 80 % (recién preparado) Termociclador Módulo de aislamiento magnético de ARNm de poli(A) NEBNext (NEB n.° E7490) o Kit de depleción de ARNr NEBNext® v2 (humano/ratón/rata) (NEB n.° E7400 o NEB n.° E7405) o Kit de depleción de globina y ARNr NEBNext® (humano/ratón/rata) (NEB n.° E7750 o NEB n.° E7755) o Kit de depleción de ARNr NEBNext® Kit de depleción (bacterias) (NEB n.º E7850 o NEB n.º E7860) o conjunto de reactivos básicos de depleción de ARN NEBNext® (NEB n.º E7865 o NEB n.º E7870) o kit de depleción de ARNr NEBNext (humano/ratón/rata) (NEB n.º E6310 o NEB n.º E6350) Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre la preparación de la biblioteca de ARN NEBNext Ultra II con perlas de purificación de muestras (NEB n.º E7775) y la preparación de la biblioteca de ARN direccional NEBNext Ultra II con perlas de purificación de muestras (NEB n.º E7765)? R: El flujo de trabajo de preparación de la biblioteca de ARN direccional NEBNext Ultra II conserva la información sobre la orientación de la cadena de ARN, mientras que el flujo de trabajo de preparación de la biblioteca de ARN NEBNext Ultra II no lo hace. La preparación de bibliotecas de ARN direccional NEBNext Ultra II contiene dUTP en el tampón de síntesis de segunda cadena, lo que permite el marcaje del ADNc de segunda cadena y su posterior escisión con la enzima USER. P: ¿Cuál es el material de partida que necesito para preparar bibliotecas con el kit de ARN direccional NEBNext Ultra II? R: El material de partida es ARN total (10 ng-1 μg); ARNm previamente aislado (1-100 ng) o ARN con depleción ribosómica (1-100 ng). P: ¿Qué kit puedo usar para aislar ARNm poli(A) del ARN total? R: Para aislar ARNm poli(A) del ARN total, utilice el módulo de aislamiento magnético de ARNm poli(A) NEBNext (NEB n.° E7490). P: ¿Qué kit puedo usar para deplecionar el ARN ribosómico (ARNr) del ARN humano, de ratón o de rata? R: Para deplecionar el ARNr de humanos, ratones o ratas, utilice el kit de depleción de ARNr NEBNext v2 (humano/ratón/rata) (NEB n.° 7400). P: ¿Es posible reducir el volumen de microesferas añadidas durante el paso de limpieza de la síntesis de la segunda cadena del protocolo para E7760, E7765, E7770 y E7775? R: El volumen total de la muestra al añadir microesferas durante el paso de limpieza de la síntesis de la segunda cadena es de 224 µl, lo que puede superar el volumen de algunos tubos y placas de PCR de 0,2 ml. Además, este volumen puede no permitir la separación completa de las microesferas con algunos tipos de imán. Muchas placas y tubos de PCR con un valor nominal de 0,2 ml tienen una capacidad real mayor, que admite una muestra de 224 µl. Sin embargo, si la placa o el tubo que prefiere usar no admite un volumen de muestra de 224 µl, es posible reducir el volumen de las perlas a 1,5 x (120 µl) para un volumen total de líquido de solo 200 µl. P: ¿Puedo usar este kit NEBNext con adaptadores y cebadores de otros proveedores que no sean NEB? R: Sí, debería ser posible usar adaptadores y cebadores de otros proveedores que no sean NEB con este kit NEBNext. El adaptador debe ser un adaptador con saliente T y el rendimiento final de la biblioteca puede ser ligeramente menor que al usar los adaptadores NEBNext para Illumina®. Las instrucciones de uso con adaptadores con código de barras de longitud completa que no sean NEBNext y cebadores de PCR universales P5 y P7 se pueden encontrar en los manuales de los adaptadores NEBNext indexados/UMI. Estos manuales se pueden encontrar en neb.com/E7416 (ARN) o neb.com/E7395 (ADN). Seleccione el manual del kit NEBNext que vaya a utilizar. Los manuales están escritos específicamente para los adaptadores NEBNext indexados/UMI; el mismo protocolo debería funcionar con otros adaptadores de diseño similar. Recomendamos realizar un experimento de prueba de principio con el kit de preparación de bibliotecas y los adaptadores indexados deseados, y utilizar muestras fungibles para optimizar las condiciones experimentales. P: ¿Qué hago si veo un precipitado en el tampón de reacción Ultra II End Prep? R: No es raro ver un precipitado blanco en el tampón de reparación de extremos Ultra II. Si esto ocurre, deje que la mezcla alcance la temperatura ambiente y pipetee el tampón varias veces para disolver el precipitado, seguido de un vórtex rápido para mezclar. P: ¿Es posible reducir el volumen de las microesferas añadidas durante el paso de limpieza de la síntesis de la segunda cadena? R: El volumen total de la muestra cuando se añaden las microesferas durante el paso de limpieza de la síntesis de la segunda cadena es de 224 µl, lo que puede superar el volumen de algunos tubos y placas de PCR de 0,2 ml. Además, este volumen puede no permitir la separación completa de las perlas utilizando algunos imanes. Muchas placas y tubos de PCR con un valor nominal de 0,2 ml tienen una capacidad real mayor que acomodará una muestra de 224 µl. Sin embargo, si la placa o el tubo que prefiere usar no permite un volumen de muestra de 224 µl, es posible reducir el volumen de perlas a 1,5 x (120 µl) para un volumen total de líquido de solo 200 µl. En nuestras manos no vimos una reducción en el rendimiento final de la biblioteca. P: ¿Cuál es la composición de los cebadores aleatorios? R: Los cebadores aleatorios son hexámeros aleatorios suministrados a 1,9 mM. P: ¿El kit incluye adaptador y cebadores? R: No. El kit se puede utilizar con los oligos multiplex NEBNext para Illumina. Para obtener una lista completa, consulte la Tabla de selección de oligos multiplex NEBNext®. Para usar con los kits de preparación de bibliotecas NEBNext, consulte el manual del kit de preparación de bibliotecas. Los manuales específicos del kit de oligonucleótidos multiplex también incluyen consejos para configurar las reacciones de PCR. Para opciones de balance de color, consulte el Selector de oligonucleótidos de índice NEBNext® para obtener combinaciones de códigos de barras válidas.