New England Biolabs, E7805S, Kit de preparación de biblioteca de ADN NEBNext® Ultra™ II FS para Illumina®

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R: Sí, recomendamos que el ADN esté en TE 1X o TE con bajo contenido de EDTA. El ADN también puede estar en Tris 10 mM pH 7,0-8,0 o H₂O. P: ¿Qué hago si veo un precipitado en el tampón de reacción Ultra II FS? R: No es raro ver precipitados en el tampón de reacción Ultra II FS. Si esto ocurre, pipetee el tampón varias veces para romper el precipitado, seguido de un vórtice rápido para mezclar. Todavía puede ver una pequeña cantidad de precipitado, pero esto no afectará el rendimiento. P: ¿Se pueden mantener las reacciones a 4 °C tras los pasos de fragmentación y preparación final del flujo de trabajo NEBNext Ultra II FS? R: Sí, el ADN fragmentado y preparado finalmente puede conservarse a 4 °C durante varias horas sin ningún efecto apreciable. Sin embargo, tras el almacenamiento durante la noche a 4 °C, se puede esperar una disminución del rendimiento de aproximadamente el 20 %. P: ¿Es realmente necesario agitar en vórtex la mezcla enzimática Ultra II FS? R: Sí, si no se agita en vórtex la mezcla enzimática Ultra II FS, los resultados pueden variar. P: ¿Qué tipo y en qué cantidad de material de partida debo utilizar al preparar bibliotecas con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II FS? R: Este kit es adecuado para 100 pg – 0,5 µg de ADN de entrada intacto. P: ¿Puedo utilizar el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II FS para la conversión con bisulfito y los flujos de trabajo EMSeq? R: No, el kit Ultra II FS no es compatible con la conversión por bisulfito ni con los flujos de trabajo EMSeq. Recomendamos utilizar cizallamiento mecánico y el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II (NEB n.° E7645) para esta aplicación. P: La reacción de ligadura es muy viscosa. ¿Qué ocurrirá si no se mezcla correctamente? R: Si la reacción de ligadura no se mezcla correctamente, es posible que se produzcan bajos rendimientos de la biblioteca. Para asegurar una mezcla adecuada, se puede pipetear la reacción 10 veces o agitar en vórtex durante 3 segundos. P: ¿Puedo usar el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II FS para preparar bibliotecas para secuenciación en los instrumentos de secuenciación Ion Torrent? R: No, los adaptadores necesarios para la secuenciación Ion Torrent tienen extremos romos en lugar de salientes 5'-T y no son compatibles con el flujo de trabajo Ultra II FS. P: ¿Cuál es la concentración de mis cebadores índice? R: Los cebadores índice NEBNext tienen una concentración de 10 µM. P: ¿Puedo usar este kit NEBNext con adaptadores y cebadores de otros fabricantes? R: Sí, debería ser posible usar adaptadores y cebadores de otros fabricantes con este kit NEBNext. El adaptador debe ser un adaptador con saliente T y el rendimiento final de la biblioteca puede ser ligeramente menor que al usar los adaptadores NEBNext para Illumina®. Las instrucciones de uso con adaptadores con código de barras de longitud completa que no sean NEBNext y cebadores universales para PCR P5 y P7 se encuentran en los manuales de los adaptadores NEBNext indexados/UMI. Estos manuales se pueden encontrar en neb.com/E7416 (ARN) o neb.com/E7395 (ADN). Seleccione el manual del kit NEBNext que vaya a utilizar. Los manuales están escritos específicamente para los adaptadores NEBNext indexados/UMI; el mismo protocolo debería funcionar con otros adaptadores de diseño similar. Recomendamos realizar un experimento de prueba de principio con el kit de preparación de biblioteca deseado y los adaptadores indexados deseados, y usar muestras fungibles para optimizar las condiciones experimentales. P: ¿El reactivo de fragmentación incluido en los kits de ADN NEBNext Ultra® II FS contiene NEBNext dsDNA Fragmentase®? R: No, los productos Ultra II FS (Sistema de Fragmentación) contienen una mezcla única de enzimas que fragmentan, reparan los extremos y dA ADN de la cola, en un solo tubo. La fragmentasa no está incluida en la mezcla de enzimas FS. P: ¿El kit de preparación de biblioteca de ADN NEBNext® Ultra™ II FS para Illumina® es compatible con todos los tipos de muestra? R: El kit de preparación de biblioteca de ADN NEBNext® Ultra™ II FS para Illumina® se ha probado en muchas aplicaciones de secuenciación, incluyendo secuenciación del genoma completo, captura de híbridos, secuenciación de amplicones y evaluación del número de copias, etc. Se ha diseñado para maximizar el número de moléculas incorporadas en una biblioteca de secuenciación. Como resultado, este método puede producir diversas bibliotecas incluso a partir de cantidades muy pequeñas de ADN de entrada (<1 ng). Tenga en cuenta lo siguiente: las modificaciones presentes en la entrada de ADN, como la metilación y la hidroximetilación, se pueden reemplazar por su forma canónica cuando se utiliza FS. Este método no se debe utilizar para aplicaciones en las que se estén estudiando bases modificadas (p. ej., EM-seq y secuenciación por bisulfito). A una frecuencia muy baja (normalmente inferior al 0,1 %), FS puede introducir artefactos identificados como quimeras o lecturas en tándem en el análisis posterior. Estos artefactos se pueden filtrar utilizando fgbio FindSwitchbackReads. Para las muestras de FFPE, hemos observado un aumento del ruido en algunas bibliotecas de FS. Sin embargo, debido a la diversidad del daño de FFPE, no es posible predecir qué muestras de FFPE exhibirán un mayor ruido. Para obtener la mejor calidad de datos, recomendamos utilizar el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultrashear FFPE (NEB n.° E6655) o el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext FFPE (NEB n.° E6650). Recomendamos a los usuarios que evalúen cuidadosamente cualquier método de preparación de bibliotecas para asegurarse de que sea adecuado para el tipo de muestra específico que se está estudiando. Si tiene alguna pregunta sobre su aplicación específica, póngase en contacto con info@neb.com. P: ¿El kit incluye adaptador y cebadores? R: No. El kit se puede utilizar con los oligos multiplex NEBNext para Illumina. Para obtener una lista completa, consulte la tabla de selección de oligos multiplex NEBNext®. Para usar con los kits de preparación de bibliotecas NEBNext, consulte el manual del kit de preparación de bibliotecas. Los manuales específicos de los kits de oligos multiplex también incluyen consejos para configurar las reacciones de PCR. Para conocer las opciones de equilibrio de color, consulte el selector de oligos de índice NEBNext® para obtener combinaciones de códigos de barras válidas.