New England Biolabs, E7810L, módulo de ADN NEBNext® Ultra™ II FS

Este módulo es parte de NEBNext Categorías relacionadas Fragmentación de ADN y fragmentación de ARN, Automatización para la preparación de bibliotecas NGS NEBNext®, Especificación de preparación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación Materiales necesarios pero no suministrados Gradilla o placa magnética (p. ej., Gradilla de separación magnética NEBNext ® (NEB n.º S1515S), Placa supermagnética Alpaqua ® 96S (n.º A001322) o equivalente) Preguntas frecuentes P: Al preparar muestras con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II FS, ¿puede mi ADN de entrada estar en soluciones que contengan EDTA? R: Sí, recomendamos que el ADN esté en TE 1X o TE con bajo contenido de EDTA. El ADN también puede estar en Tris 10 mM pH 7,0-8,0 o H20. P: ¿Qué hago si veo un precipitado en el tampón de reacción Ultra II FS? R: Es frecuente observar precipitación en el tampón de reacción Ultra II FS. Si esto ocurre, pipetee el tampón varias veces para deshacer el precipitado y, a continuación, agite rápidamente con un vórtex para mezclar. Es posible que aún se observe una pequeña cantidad de precipitación, pero esto no afectará el rendimiento. P: Tras los pasos de fragmentación y preparación final del flujo de trabajo NEBNext Ultra II FS, ¿se pueden mantener las reacciones a 4 °C? R: Sí, el ADN fragmentado y preparado con el extremo final puede mantenerse a 4 °C durante varias horas sin ningún efecto apreciable. Sin embargo, tras el almacenamiento durante la noche a 4 °C, se puede esperar una disminución del rendimiento de aproximadamente el 20 %. P: ¿Es realmente necesario agitar con vórtex la mezcla enzimática Ultra II FS? R: Sí, si no se agita con vórtex la mezcla enzimática Ultra II FS, los resultados pueden variar. P: ¿Cuál es la concentración de mis cebadores índice? R: Los cebadores índice NEBNext tienen una concentración de 10 µM. P: ¿Qué módulo de ligadura NEBNext debe usarse junto con el módulo de ADN NEBNext Ultra II FS? R: El módulo está diseñado para usarse con el módulo de ligadura NEBNext Ultra II (NEB n.° E7595). P: ¿Puedo usar el módulo de ADN NEBNext® Ultra™ II FS para la conversión con bisulfito y los flujos de trabajo de metil-seq enzimático (EM-seq™)? R: No, el módulo de ADN NEBNext Ultra II FS no es compatible con la conversión con bisulfito ni con los flujos de trabajo de EM-seq. Recomendamos usar NEBNext UltraShear™ (NEB n.° M7634) o cizallamiento mecánico, seguido del módulo de reparación de extremos de ADN/colas de dA NEBNext Ultra II (NEB n.° E7546) para esta aplicación. Después de la fragmentación con NEBNext UltraShear, puede pasar directamente a la reacción de reparación de extremos/colas de dA, como se describe en la sección 2 del manual de NEBNext UltraShear, sin necesidad de limpieza. P: ¿El reactivo de fragmentación incluido en los kits de ADN NEBNext Ultra® II FS contiene NEBNext dsDNA Fragmentase®? R: No, los productos Ultra II FS (Sistema de Fragmentación) contienen una mezcla única de enzimas que fragmentan, reparan los extremos y forman la cola de ADN dA, todo en un solo tubo. La fragmentasa no está incluida en la mezcla de enzimas FS. P: ¿El kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext® Ultra™ II FS para Illumina® es compatible con todos los tipos de muestras? R: El kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext® Ultra™ II FS para Illumina® se ha probado en diversas aplicaciones de secuenciación, como la secuenciación del genoma completo, la captura de híbridos, la secuenciación de amplicones y la evaluación del número de copias, entre otras. Está diseñado para maximizar el número de moléculas incorporadas en una biblioteca de secuenciación. Como resultado, este método permite producir diversas bibliotecas incluso a partir de cantidades muy pequeñas de ADN de entrada (< 1 ng). Tenga en cuenta lo siguiente: Las modificaciones presentes en la entrada de ADN, como la metilación y la hidroximetilación, pueden reemplazarse por su forma canónica cuando se utiliza FS. Este método no debe utilizarse para aplicaciones en las que se estén estudiando bases modificadas (p. ej., EM-seq y secuenciación por bisulfito). A una frecuencia muy baja (normalmente inferior al 0,1 %), FS puede introducir artefactos identificados como quimeras o lecturas en tándem en el análisis posterior. Estos artefactos pueden filtrarse utilizando fgbio FindSwitchbackReads. En el caso de las muestras FFPE, hemos observado un aumento del ruido en algunas bibliotecas FS. Sin embargo, debido a la diversidad de daños en FFPE, no es posible predecir qué muestras FFPE exhibirán un mayor ruido. Para obtener la mejor calidad de los datos, recomendamos utilizar el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultrashear FFPE (NEB n.º E6655) o el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext FFPE (NEB n.º E6650). Recomendamos a los usuarios evaluar cuidadosamente cualquier método de preparación de la biblioteca para garantizar que sea adecuado para el tipo de muestra específico que se está estudiando. Si tiene alguna pregunta sobre su aplicación específica, contáctenos en info@neb.com.