Kit de depleción de ARNr NEBNext® (bacterias) de New England Biolabs, E7850X

El ARN ribosómico (ARNr) es muy abundante en muestras bacterianas, y su eliminación es deseable para revelar la importancia biológica de las transcripciones menos abundantes. El enriquecimiento específico de ARNm bacterianos es difícil debido a su falta de colas de poli(A), por lo que lo inverso, es necesario: la eliminación eficiente y específica del ARNr bacteriano. Categorías relacionadas: Depleción de ARN y enriquecimiento de ARNm, Análisis del epitranscriptoma, Preparación de bibliotecas de ARN para Illumina, Especificación: Materiales necesarios pero no suministrados: Gradilla magnética (NEB n.° S1515) o placa magnética (Alpaqua, cat. n.° A001322) o equivalente; Etanol al 80 % (recién preparado); Termociclador; Cualquier tubo de PCR de pared fina de 200 μl y tubos de 1,5 ml; Bioanalizador, Tapestation. (Agilent Technologies, Inc.) o instrumento similar y consumibles Agencourt® RNAClean® XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63987) Preguntas frecuentes P: ¿Qué subunidades de ARNr bacteriano se eliminan con el kit de eliminación de ARNr NEBNext para bacterias? R: El kit elimina las subunidades de ARNr 5S, 16S y 23S. P: ¿Se puede usar el kit de eliminación de ARNr NEBNext® (para bacterias) en muestras metatranscriptómicas? R: Sí, dado que las sondas están diseñadas contra el ARNr de varias especies, la eliminación será efectiva tanto en monocultivos como en comunidades microbianas mixtas (grampositivas y gramnegativas). P: ¿Cómo puedo eliminar el ARNr de una mezcla de muestras de mamíferos y bacterias? R: Las sondas del NEBNext® rRNA Depletion Kit v2 (Human/Mouse/Rat) (NEB #E7400/E7405) o del NEBNext Globin & rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (NEB #E7750/E7755) se pueden mezclar en cantidades iguales con las sondas del NEBNext® rRNA Depletion Kit (Bacteria) para el agotamiento en una muestra mixta. Dependiendo de la cantidad de ARNr de mamíferos en relación con el ARNr bacteriano, las cantidades de sonda se pueden titular aún más. Consulte la información aquí. P: ¿Cuál es el porcentaje de ARNr bacteriano restante después del agotamiento? R: El porcentaje de ARNr bacteriano restante después del agotamiento variará según la muestra. Para varias especies diferentes, esperamos ver entre un 1 % y un 5 % de ARNr restante. Sin embargo, dependiendo de la diversidad de la especie y su secuencia de ARNr, también se puede observar un mayor % de ARNr. P: ¿Cómo puedo determinar si la depleción de ARNr fue eficiente? R: Para evaluar la eficiencia de la depleción, diseñe cebadores RT qPCR para el ARNr de la especie de muestra y cebadores para un gen constitutivo. Compare el contenido de ARNr antes y después de la depleción. P: ¿Puedo usar este producto con ARN degradado o ARN fragmentado? R: Sí, este kit se puede usar con ARN degradado o fragmentado. P: ¿Cuál es la entrada total de ARN que debo usar? R: El kit ha sido optimizado para una entrada total de ARN de 10-1000 ng (100 ng mínimo para ARN fragmentado o degradado). Para RNA-seq, recomendamos usar entradas superiores a 100 ng para aumentar la complejidad de la biblioteca y reducir la tasa de duplicación. P: ¿Por qué el ARN debe estar libre de ADN? R: El ADN contaminante puede causar una cuantificación inexacta del ARN e impedir la eliminación adecuada del ARNm y ARNr de globina. P: ¿Qué comunidad de microbioma se utilizó en los experimentos de depleción descritos y qué referencias se utilizaron para evaluar el rendimiento del kit de depleción de ARNr NEBNext® (bacterias) con esta muestra? R: El material de células completas ATCC 20 Strain Even Mix (ATCC® MSA-2002™) se utilizó en el experimento de depleción. Se construyó un genoma de referencia compuesto a partir de genomas del NCBI para evaluar el rendimiento del kit. La referencia compuesta está disponible en https://doi.org/10.5281/zenodo.3386404 P: ¿Puedo usar las perlas magnéticas Agencourt® AMPure® XP en lugar de las perlas de purificación de muestras de ARN NEBNext® (perlas magnéticas RNAClean® XP)? R: Sí, es posible usar perlas AMPure XP. Sin embargo, recomendamos usar las perlas RNAClean XP/perlas de purificación de muestras de ARN NEBNext® (suministradas en NEB #E7860) ya que estas perlas han sido fabricadas y probadas para eliminar la contaminación por ARNasa. Una versión del kit incluye estas perlas: NEBNext® rRNA Depletion Kit (Bacteria) con perlas de purificación de muestras de ARN (NEB #E7860). P: ¿Puedo usar métodos de purificación diferentes a las perlas de purificación de muestras de ARN NEBNext®/perlas magnéticas Agencourt® RNAClean® XP? R: Aunque recomendamos usar perlas RNAClean® XP NEBNext® RNA Sample Purification Beads (suministradas en NEB #E7755), las muestras con ARNr deplecionado se pueden purificar alternativamente por precipitación con etanol o usando limpiezas de columnas de ARN como el kit de limpieza de ARN Monarch Spin (NEB #T2030). Para usar con otras columnas, verifique la especificación de la columna para el rango de tamaño de ARN para asegurarse de que cualquier ARN fragmentado se conservará durante la limpieza. P: ¿Qué especies se han analizado con el kit de depleción de ARNr NEBNext (bacterias)? R: Puede encontrar información sobre las especies analizadas hasta la fecha aquí. P: ¿Se puede utilizar el ARN enriquecido resultante del kit de depleción NEBNext en secuenciaciones de lectura larga? R: Sí, pero tenga en cuenta que el ARN se fragmenta ligeramente durante el proceso de depleción. Esto puede reducir la longitud de lectura.