Kit de depleción de ARNr NEBNext® (bacterias) con microesferas de purificación de muestras de ARN, E7860X, de New England Biolabs

El ARN ribosómico (ARNr) es muy abundante en muestras bacterianas, y su eliminación es deseable para revelar la importancia biológica de las transcripciones menos abundantes. El enriquecimiento específico de ARNm bacterianos es difícil debido a su falta de colas de poli(A), por lo que lo inverso, es necesario: la eliminación eficiente y específica del ARNr bacteriano. Categorías relacionadas: Depleción de ARN y enriquecimiento de ARNm, Análisis del epitranscriptoma, Preparación de bibliotecas de ARN para Illumina, Especificación: Materiales necesarios pero no suministrados: Gradilla magnética (NEB n.° S1515) o placa magnética (Alpaqua, cat. n.° A001322) o equivalente; Etanol al 80 % (recién preparado); Termociclador; Cualquier tubo de PCR de pared fina de 200 μl y tubos de 1,5 ml; Bioanalizador, Tapestation. (Agilent Technologies, Inc.) o instrumentos y consumibles similares. Preguntas frecuentes : P: ¿Qué subunidades de ARNr bacteriano se depletan con el kit de depleción de ARNr NEBNext® (Bacteria)? R: El kit depleciona las subunidades 5S, 16S y 23S del ARNr. P: ¿Se puede utilizar el kit de depleción de ARNr NEBNext® (Bacteria) en muestras metatranscriptómicas? R: Sí, dado que las sondas están diseñadas contra ARNr de varias especies, la depleción será eficaz tanto en monocultivos como en comunidades microbianas mixtas (grampositivas y gramnegativas). P: ¿Cómo puedo eliminar el ARNr de una mezcla de muestras de mamíferos y bacterias? R: Las sondas del NEBNext® rRNA Depletion Kit v2 (Human/Mouse/Rat) (NEB #E7400/E7405) o del NEBNext Globin & rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (NEB #E7750/E7755) se pueden mezclar en cantidades iguales con las sondas del NEBNext® rRNA Depletion Kit (Bacteria) para el agotamiento en una muestra mixta. Dependiendo de la cantidad de ARNr de mamíferos en relación con el ARNr bacteriano, las cantidades de sonda se pueden titular aún más. Consulte la información aquí. P: ¿Cuál es el porcentaje de ARNr bacteriano restante después del agotamiento? R: El porcentaje de ARNr bacteriano restante después del agotamiento variará según la muestra. Para varias especies diferentes, esperamos ver entre un 1 % y un 5 % de ARNr restante. Sin embargo, dependiendo de la diversidad de la especie y su secuencia de ARNr, también se puede observar un mayor % de ARNr. P: ¿Cómo puedo determinar si la depleción de ARNr fue eficiente? R: Para evaluar la eficiencia de la depleción, diseñe cebadores RT qPCR para el ARNr de la especie de muestra y cebadores para un gen constitutivo. Compare el contenido de ARNr antes y después de la depleción. P: ¿Puedo usar este producto con ARN degradado o ARN fragmentado? R: Sí, este kit se puede usar con ARN degradado o fragmentado. P: ¿Cuál es la entrada total de ARN que debo usar? R: El kit ha sido optimizado para una entrada total de ARN de 10-1000 ng (100 ng mínimo para ARN fragmentado o degradado). Para RNA-seq, recomendamos usar entradas superiores a 100 ng para aumentar la complejidad de la biblioteca y reducir la tasa de duplicación. P: ¿Por qué el ARN debe estar libre de ADN? R: El ADN contaminante puede causar una cuantificación inexacta del ARN e impedir la eliminación adecuada del ARNm y ARNr de globina. P: ¿Qué comunidad de microbioma se utilizó en los experimentos de depleción descritos y qué referencias se utilizaron para evaluar el rendimiento del kit de depleción de ARNr NEBNext® (Bacteria) con esta muestra? R: El material de células completas ATCC 20 Strain Even Mix (ATCC® MSA-2002™) se utilizó en el experimento de depleción. Se construyó un genoma de referencia compuesto a partir de genomas del NCBI para evaluar el rendimiento del kit. La referencia compuesta está disponible en https://doi.org/10.5281/zenodo.3386404 P: ¿Qué especies se han probado con el kit de depleción de ARNr NEBNext (Bacteria)? R: Puede encontrar información sobre las especies probadas hasta la fecha aquí. P: ¿Puede el ARN enriquecido resultante del kit de depleción NEBNext utilizarse en aplicaciones de secuenciación de lectura larga? R: Sí, pero tenga en cuenta que el ARN se fragmenta ligeramente durante el proceso de depleción. Esto puede reducir la longitud de lectura.