New England Biolabs, E7865S, NEBNext® Conjunto de reactivos básicos para la depleción de ARN

Presentamos una nueva solución para la depleción personalizada de ARN abundantes. Categorías relacionadas Depleción de ARN y enriquecimiento de ARNm, Análisis del epitranscriptoma, Preparación de bibliotecas de ARN para Illumina, Preguntas frecuentes P: ¿Cómo puedo diseñar sondas de ADN para usar con el conjunto de reactivos centrales de depleción de ARN NEBNext? R: Puede diseñar sondas de ADN monocatenarias utilizando la herramienta de diseño de depleción de ARN personalizada NEBNext. Deberá proporcionar la secuencia de ARN que desea depletar de 5' a 3' en formato FASTA. P: ¿Las sondas diseñadas por la herramienta de diseño de depleción de ARN personalizada NEBNext son sentido o antisentido? R: Las sondas resultantes serán antisentido a la secuencia de ARN que ingrese en la herramienta de diseño de depleción de ARN personalizada NEBNext. P: ¿Puede la secuencia de entrada en la herramienta de diseño de depleción de ARN personalizada NEBNext contener el código de ambigüedad IUPAC? R: No. La secuencia de entrada solo debe contener nucleótidos A, C, G o T. P: ¿La herramienta de diseño de depleción de ARN personalizada de NEBNext busca sondas dirigidas a transcripciones distintas a las proporcionadas? R: No. La herramienta de diseño de depleción de ARN personalizada de NEBNext diseña sondas basándose en la secuencia de ARN proporcionada. Al seleccionar la secuencia de ARN que se va a deplecionar, se recomienda comprobar la homología de secuencia con otras transcripciones de interés. P: He utilizado la herramienta de diseño de depleción de ARN personalizada de NEBNext y he obtenido secuencias de sondas, ¿cuál es el siguiente paso? R: El siguiente paso es solicitar las sondas a su proveedor de síntesis de oligonucleótidos preferido. La purificación estándar de oligonucleótidos por desalinización es suficiente para esta aplicación. No se requieren modificaciones en los extremos 5' ni 3'. Consulte el manual del conjunto de reactivos básicos de depleción de ARN de NEBNext para obtener más información. P: ¿Cómo puedo crear un conjunto de sondas funcional para utilizarlo con el conjunto de reactivos básicos de depleción de ARN de NEBNext? R: Recomendamos preparar un pool de sondas equimolar con sondas de entre 2 y 4 µM cada una y, a continuación, usar de 1 a 3 µl de este pool en el paso de hibridación del protocolo del NEBNext RNA Depletion Core Reagent Set. Es posible que se requiera optimizar la cantidad de sonda para una depleción eficiente del ARN deseado. P: ¿Cuál es el número máximo de sondas que se pueden combinar en un pool? R: El protocolo de depleción se ha probado con hasta 1000 sondas. El uso de un pool de sondas mayor requerirá pruebas. P: ¿Puedo usar este producto con ARN degradado o fragmentado? R: Sí, este kit se puede usar con ARN degradado o fragmentado. P: ¿Qué cantidad total de ARN debo usar con el NEBNext RNA Depletion Core Reagent Set? R: Recomendamos usar de 10 a 1000 ng de ARN total. P: ¿Por qué el ARN debe estar libre de ADN? R: El ADN contaminado puede causar una cuantificación inexacta del ARN e impedir la correcta eliminación del ARNm y ARNr de globina. P: ¿Cómo puedo determinar si la depleción de ARN fue eficiente? R: Para evaluar la eficiencia de la depleción, diseñe cebadores de RT qPCR para el ARN deplecionado y cebadores para un gen constitutivo. Compare el contenido de ARN antes y después de la depleción. P: ¿Puedo usar las perlas magnéticas Agencourt®AMPure XP en lugar de las perlas magnéticas RNAClean® XP/perlas de purificación de muestras de ARN NEBNext®? R: Sí, es posible usar las perlas AMPure XP. Sin embargo, recomendamos usar las perlas RNAClean XP/perlas de purificación de muestras de ARN NEBNext®, ya que estas perlas han sido fabricadas y probadas para eliminar la contaminación por ARNasa. Una versión del kit incluye estas perlas: NEBNext® RNA Depletion Core Reagent Set con perlas de purificación de muestras de ARN (NEB n.° E7870). P: ¿Puedo usar métodos de purificación distintos a las perlas de purificación de muestras de ARN NEBNext®/perlas magnéticas Agencourt® RNAClean® XP con el juego de reactivos centrales de depleción de ARN NEBNext? R: Aunque recomendamos usar perlas RNAClean® XP (suministradas en NEB n.º E7870), las muestras deplecionadas de ARN se pueden purificar alternativamente mediante precipitación con etanol o utilizando limpiadores de columnas de ARN como el kit de limpieza de ARN Monarch (NEB n.º T2030). Para usar con otras columnas, verifique la especificación de la columna para el rango de tamaño de ARN para asegurarse de que cualquier ARN fragmentado se conservará durante la limpieza. P: ¿La herramienta de depleción de ARN personalizada de NEBNext verifica la redundancia o superposición de sondas entre las secuencias de ARN objetivo ingresadas? R: No. La herramienta de depleción de ARN personalizada de NEBNext diseña sondas para todas las secuencias ingresadas de forma independiente, incluso si se ingresan al mismo tiempo. No verifica la redundancia o superposición de sondas entre múltiples entradas. P: ¿Se puede utilizar el ARN enriquecido resultante del kit de depleción NEBNext en secuenciaciones de lecturas largas? R: Sí, pero tenga en cuenta que el ARN se fragmenta ligeramente durante el proceso de depleción. Esto puede reducir la longitud de lectura.