New England Biolabs, E7876S, NEBNext® Multiplex Oligos para Illumina® (Conjunto de adaptadores de ADN UMI de índice dual único 3)

Categorías relacionadas con NEBNext Oligos multiplex NEBNext® (adaptadores y cebadores), preguntas frecuentes sobre la preparación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación P: ¿Cuál es la diferencia entre los adaptadores UMI de índice dual único NEBNext y los adaptadores NEBNext para usar con cebadores multiplex? R: Los adaptadores UMI de índice dual único NEBNext son adaptadores de longitud completa con código de barras que contienen todas las secuencias necesarias para la secuenciación en las plataformas Illumina. Son compatibles con la preparación de bibliotecas sin PCR. Además, estos adaptadores llevan un identificador molecular único (UMI) de 12 bases 3' al índice i7, lo que permite una eliminación más precisa de lecturas duplicadas y la corrección de errores mediante la construcción de secuencias de consenso. Por otro lado, el adaptador NEBNext está truncado y no contiene índice de muestra. El índice y otras secuencias necesarias para la secuenciación en la plataforma Illumina se introducen a través de cebadores durante la amplificación por PCR cuando se utiliza el adaptador NEBNext. Por lo tanto, las bibliotecas generadas con el adaptador NEBNext no son compatibles con la preparación de bibliotecas sin PCR. P: ¿Cuáles son las principales aplicaciones de los conjuntos de ADN 1-4 de adaptadores UMI de índice dual único NEBNext? R: Los conjuntos de ADN 1-4 de adaptadores UMI de índice dual único NEBNext se recomiendan para aplicaciones que requieren la preparación de bibliotecas sin PCR y la agrupación de muestras antes de la amplificación por PCR. Además, la incorporación de un identificador molecular único (UMI) de 12 bases permite 1) la identificación precisa y la eliminación de lecturas duplicadas, y 2) la construcción de secuencias de consenso y la corrección de errores, idealmente adecuado para el análisis preciso de datos cuantitativos de NGS, incluida la detección de mutaciones de baja frecuencia. Además, los adaptadores UMI de índice dual único se diseñaron para facilitar la secuenciación en celdas de flujo con patrón para los instrumentos Illumina donde el salto de índice es problemático. La combinación única de índices duales permite la identificación y el filtrado completo de lecturas con índice intercambiado. Español: https://www.biorxiv.org/content/early/2017/10/10/200790 P: ¿Qué longitud tienen los UMI y dónde se encuentran en los adaptadores? R: Los UMI tienen 12 bases de longitud y se ubican 3′ con respecto a los índices i7. P: ¿Cómo se secuencian los UMI y dónde puedo encontrarlos? R: Los UMI se secuencian como parte de las lecturas del índice i7 para un total de 20 bases. Se pueden encontrar en las lecturas del índice i7. P: ¿Puedo omitir la secuenciación de UMI si no necesito los UMI para mis aplicaciones? R: Sí. Puede omitir la secuenciación de UMI y configurar la lectura del índice i7 en 8 bases en este caso. El diseño de los adaptadores NEBNext Unique Dual Index UMI permite modos de secuenciación de índice flexibles y son compatibles con lecturas de índice único (con y sin UMI) y lecturas de índice dual (con y sin UMI). P: ¿Son los conjuntos de adaptadores de ADN NEBNext Unique Dual Index UMI 1-4 compatibles con los reactivos NEBNext para la preparación de bibliotecas de Illumina? R: Sí, los conjuntos de adaptadores de ADN NEBNext Unique Dual Index UMI 1-4 son compatibles con los kits NEBNext para la preparación de bibliotecas de ADN, ARN y ChIP-Seq de Illumina. Sin embargo, no son compatibles con la preparación de bibliotecas de ARN pequeño de Illumina. Para la preparación de bibliotecas de ARN pequeño para Illumina, consulte nuestros kits (NEB n.° E7300 y E7580), que contienen su propio adaptador y cebadores con código de barras. P: ¿Son los conjuntos de adaptadores de ADN NEBNext Unique Dual Index UMI 1-4 compatibles con los reactivos de preparación de bibliotecas disponibles comercialmente? R: Solo son compatibles con los protocolos estándar de preparación de bibliotecas basados ​​en la ligadura de una sola base con saliente T/A. P: ¿Cuántas reacciones de adaptadores UMI hay en cada pocillo? R: La placa adaptadora fue diseñada para un solo uso. Aunque cada pocillo contiene suficiente adaptador para una sola reacción, proporcionamos adaptadores adicionales para garantizar un volumen suficiente. Recomendamos encarecidamente no utilizar adaptadores sobrantes para evitar la contaminación cruzada con otros adaptadores indexados. P: ¿Están metilados los adaptadores? R: No, los adaptadores de los NEB n.° E7395, E7874, E7876 y E7878 no están metilados y, por lo tanto, no son compatibles con la secuenciación por bisulfito. Para obtener información sobre adaptadores metilados y cebadores indexados, consulte el NEB n.° E7140. P: ¿Cuál es la concentración de los adaptadores y la mezcla de cebadores para PCR en los oligonucleótidos NEBNext Multiplex (conjuntos de ADN de adaptadores UMI de índice dual único 1-4)? R: Los adaptadores son de 20 µM y los cebadores de 40 µM. P: ¿Cuántos índices hay disponibles con los oligonucleótidos NEBNext Multiplex para Illumina (conjuntos de ADN de adaptadores UMI de índice dual único 1-4)? R: Cada juego consta de 96 índices i5 únicos y 96 i7 únicos, lo que proporciona hasta 96 índices duales únicos. Cada pocillo de la placa adaptadora contiene un par único de un índice i5 y un índice i7. Utilizados en conjunto, los juegos 1-4 proporcionan 384 pares de cebadores de índice dual únicos para multiplexación. P: ¿Están validados los juegos de ADN 1-4 de adaptadores UMI de índice dual único NEBNext en flujos de trabajo de secuenciación de nueva generación? R: Sí, los adaptadores UMI NEBNext se validan mediante la preparación de bibliotecas de ADN genómico y bibliotecas de ARNm humano, seguidas de la secuenciación de Illumina. P: ¿Son compatibles los adaptadores UMI NEBNext con la secuenciación de extremo único y de extremo emparejado? R: Sí, los adaptadores UMI NEBNext son compatibles con la secuenciación de extremo único y de extremo emparejado. P: ¿Es necesario añadir cebadores de secuenciación personalizados al secuenciar bibliotecas creadas con oligonucleótidos multiplex NEBNext para Illumina (conjuntos de ADN 1-4 de adaptadores UMI de índice dual único) en las plataformas Illumina? R: No. Las bibliotecas creadas con oligonucleótidos multiplex NEBNext para Illumina (conjuntos de ADN 1-4 de adaptadores UMI de índice dual único) son totalmente compatibles con los protocolos de secuenciación de Illumina de las bibliotecas TruSeq HT. Para sistemas HiSeq, HiScanSQ o GAIIx en celdas de flujo de lectura única, la caja de cebadores de secuenciación de índice dual TruSeq, lectura única (caja de un solo uso) (n.° de catálogo FC-121-1003) deberá solicitarse por separado si se utilizan ambos índices. Esta caja adicional no es necesaria con el sistema MiSeq ni en celdas de flujo de extremo emparejado para HiSeq, HiScanSQ y GAIIx. Consulte el sitio web de Illumina para obtener información completa. P: ¿Puedo realizar ejecuciones de lectura única y obtener ambas secuencias de índice? ¿Puedo ejecutar recetas de lectura única y de extremo emparejado con bibliotecas de doble índice? R: Sí. Seleccione el flujo de trabajo adecuado según el tipo de celda de flujo (lectura única o extremo emparejado) al iniciar su ejecución para utilizar la química correcta. Si utiliza una celda de flujo de lectura única, se necesita la caja de cebadores de secuenciación de doble índice TruSeq de lectura única (caja de un solo uso) (n.° de catálogo FC-121-1003) para secuenciar ambas lecturas de índice. Adaptado del sitio web de Illumina. P: ¿Dónde puedo encontrar las hojas de muestra de los conjuntos de ADN 1-4 de adaptadores UMI de doble índice único NEBNext? A: Las hojas de muestra específicas del instrumento se pueden descargar de la sección Instrucciones de uso ubicada en la pestaña "Protocolos, manual y uso" en la página de producto del conjunto correspondiente, o encuéntrelas en la siguiente tabla: Adaptadores UMI de índice doble único NEBNext ADN: Versión de la hoja de muestra: Nombre del archivo (incluye detalles de la plataforma Illumina*): Conjunto 1 (NEB n.° E7395) Hoja de muestra de flujo de trabajo de cadena directa para E7395: NovaSeq 6000 con kits de reactivos v1.0, MiniSeq con kits de reactivos rápidos, MiSeq, HiSeq 2000/2500 (celda de flujo de extremo emparejado), HiSeq 3000/4000 (celda de flujo de lectura única) Hoja de muestra de flujo de trabajo de complemento inverso inverso para E7395: iSeq 100, MiniSeq con kits de reactivos estándar, sistemas NextSeq, NovaSeq 6000 con kits de reactivos v1.5, HiSeq 2000/2500 (celda de flujo de lectura única), HiSeq 3000/4000 (celda de flujo de extremos emparejados) UMI Hoja de muestra de flujo de trabajo de cadena directa hacia adelante para E7395 UMI: NovaSeq 6000 con kits de reactivos v1.0, MiniSeq con kits de reactivos rápidos, MiSeq, HiSeq 2000/2500 (celda de flujo de extremos emparejados), HiSeq 3000/4000 (celda de flujo de lectura única) UMI Hoja de muestra de flujo de trabajo de complemento inverso inverso para E7395 UMI: iSeq 100, MiniSeq con kits de reactivos estándar, NextSeq Systems, NovaSeq 6000 con kits de reactivos v1.5, HiSeq 2000/2500 (celda de flujo de lectura única), HiSeq 3000/4000 (celda de flujo de extremos emparejados) Juego 2 (NEB n.° E7874) Hoja de muestra de flujo de trabajo de cadena directa hacia adelante para E7874: NovaSeq 6000 con kits de reactivos v1.0, MiniSeq con kits de reactivos rápidos, MiSeq, HiSeq 2000/2500 (celda de flujo de extremo emparejado), HiSeq 3000/4000 (celda de flujo de lectura única) Hoja de muestra de flujo de trabajo de complemento inverso inverso para E7874: iSeq 100, MiniSeq con kits de reactivos estándar, sistemas NextSeq, NovaSeq 6000 con kits de reactivos v1.5, HiSeq 2000/2500 (celda de flujo de lectura única), HiSeq 3000/4000 (celda de flujo de extremo emparejado) UMI Hoja de muestra de flujo de trabajo de cadena directa para E7874 UMI: NovaSeq 6000 con kits de reactivos v1.0, MiniSeq con kits de reactivos rápidos, MiSeq, HiSeq 2000/2500 (celda de flujo de extremo emparejado), HiSeq 3000/4000 (celda de flujo de lectura única) UMI Reverse Reverse Complement Workflow Sample Sheet para E7874 UMI: iSeq 100, MiniSeq con kits de reactivos estándar, NextSeq Systems, NovaSeq 6000 con kits de reactivos v1.5, HiSeq 2000/2500 (celda de flujo de lectura única), HiSeq 3000/4000 (celda de flujo de extremos emparejados) Set 3 (NEB #E7876) Forward Forward Strand Workflow Sample Sheet para E7876: NovaSeq 6000 con kits de reactivos v1.0, MiniSeq con kits de reactivos rápidos, MiSeq, HiSeq 2000/2500 (celda de flujo de extremos emparejados), HiSeq 3000/4000 (celda de flujo de lectura única) Reverse Reverse Complement Workflow Sample Sheet para E7876: iSeq 100, MiniSeq con reactivo estándar kits, NextSeq Systems, NovaSeq 6000 con kits de reactivos v1.5, HiSeq 2000/2500 (celda de flujo de lectura única), HiSeq 3000/4000 (celda de flujo de extremo emparejado) Hoja de muestra de flujo de trabajo de cadena directa UMI para E7876 UMI: NovaSeq 6000 con kits de reactivos v1.0, MiniSeq con kits de reactivos rápidos, MiSeq, HiSeq 2000/2500 (celda de flujo de extremo emparejado), HiSeq 3000/4000 (celda de flujo de lectura única) Hoja de muestra de flujo de trabajo de complemento inverso UMI para E7876 UMI: iSeq 100, MiniSeq con kits de reactivos estándar, NextSeq Systems, NovaSeq 6000 con kits de reactivos v1.5, HiSeq 2000/2500 (celda de flujo de lectura única), HiSeq 3000/4000 (celda de flujo de extremos emparejados) Juego 4 (NEB n.° E7878) Hoja de muestra de flujo de trabajo de cadena directa para E7878: NovaSeq 6000 con kits de reactivos v1.0, MiniSeq con kits de reactivos rápidos, MiSeq, HiSeq 2000/2500 (celda de flujo de extremos emparejados), HiSeq 3000/4000 (celda de flujo de lectura única) Hoja de muestra de flujo de trabajo de complemento inverso para E7878: iSeq 100, MiniSeq con kits de reactivos estándar, NextSeq Systems, NovaSeq 6000 con kits de reactivos v1.5, HiSeq 2000/2500 (celda de flujo de lectura única), HiSeq 3000/4000 (celda de flujo de extremos emparejados) UMI Hoja de muestra de flujo de trabajo de cadena directa para E7878 UMI: NovaSeq 6000 con reactivo v1.0 kits, MiniSeq con kits de reactivos rápidos, MiSeq, HiSeq 2000/2500 (celda de flujo de extremo emparejado), HiSeq 3000/4000 (celda de flujo de lectura única) Hoja de muestra de flujo de trabajo de complemento inverso UMI para E7878 UMI: iSeq 100, MiniSeq con kits de reactivos estándar, sistemas NextSeq, NovaSeq 6000 con kits de reactivos v1.5, HiSeq 2000/2500 (celda de flujo de lectura única), HiSeq 3000/4000 (celda de flujo de extremo emparejado) * Nuestras hojas de muestras se basan en la Guía general de secuenciación de Illumina actual. Elija la hoja de muestra correcta, según su instrumento Illumina y sus kits de reactivos. Para obtener más información sobre la indexación de Illumina, consulte la versión más reciente de la Guía general de secuenciación de Illumina. P: ¿Qué secuencias deben recortarse para las bibliotecas NEBNext que se secuencian en un instrumento Illumina? R: Las bibliotecas NEBNext para Illumina se parecen a las bibliotecas TruSeq y se pueden recortar como TruSeq: Adaptador Read1 AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA Adaptador Read2 AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT P: ¿Qué hago si recibo un error de colisión de índice/colisión de código de barras? R: Si recibió un error de colisión de índice al demultiplexar los oligonucleótidos multiplex NEBNext, actualice a: Versión de software Bclconvert 4.1.7 o posterior Bcl2fastq Cualquier versión Picard IlluminaBasecallsToSam Cualquier versión Comuníquese con el soporte técnico si tiene más preguntas.