New England Biolabs, E8015L, Kit enzimático de metil-seq v2 NEBNext®

NEBNext Enzymatic Methyl-seq (EM-seq Categorías relacionadas Conversión enzimática para análisis de metilación de ADN, Análisis de metiloma, Análisis de metilación de ADN, Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Instrumento NEBNext UltraShear® (M7634) o Covaris® y los tubos requeridos u otro equipo de fragmentación Tubos de tiras de PCR o placas de 96 pocillos Perlas de limpieza: Kit de reactivos SPRIselect (Beckman Coulter®, Inc. #B23317), perlas AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. #A63881) o fabricante de perlas preferido Formamida Hi-Di™ (Thermo Fisher Scientific® #4401457), formamida (Sigma #F9037-100 ml) o NaOH 0,05 N. Se prefiere la formamida. Si usa NaOH, consulte las preguntas frecuentes asociadas con NEB #E8015. 80% Etanol 10 mM Tris-HCl pH 7,5 u 8,0 o TE bajo (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA) Agua libre de nucleasas Soporte/gradilla magnética, como la gradilla de separación magnética NEBNext (NEB n.° S1515) Bloque de refrigeración metálico, como Diversified Biotech® (n.° CHAM-1000) Preguntas frecuentes sobre la máquina de PCR P: ¿Cuál es la diferencia entre el kit NEBNext® Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB n.° E8015) y el kit NEBNext Enzymatic Methyl-seq original (NEB n.° E7120)? R: El kit NEBNext Enzymatic Methyl-seq v2 tiene un rango de entrada más amplio (100 pg - 200 ng) y un flujo de trabajo más rápido y optimizado que reduce el uso de consumibles. La calidad general de los datos se mejora, con mayores rendimientos y menores tasas de duplicación, lo que resulta en mayores niveles de cobertura de CpG en un rango de entrada más amplio. P: ¿Qué es ¿Cuál es la diferencia entre el kit NEBNext® Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB n.° E8015) y el módulo de conversión Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB n.° E8020)? R: El kit NEBNext Enzymatic Methyl-seq v2 contiene los componentes necesarios para crear una biblioteca EM-seq™, incluyendo reactivos para la preparación de extremos, la ligadura de adaptadores, la protección 5mC/5hmC, la desaminación de citosina y la mezcla maestra NEBNext Q5U para la amplificación. El kit EM-seq v2 se puede combinar con cualquiera de los cebadores de doble índice únicos de LV. El módulo de conversión Enzymatic Methyl-seq v2 no contiene reactivos para la preparación de bibliotecas, la amplificación ni adaptadores ni cebadores. P: ¿Qué tipos de muestras se pueden procesar con el kit NEBNext® Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB n.° E8015) y el módulo de conversión Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB n.° E8020)? #E8020)? R: NEBNext Enzymatic Methyl-seq se puede usar con ADN genómico, ADN libre de células y ADN FFPE. P: ¿Cuáles son los insumos recomendados para el kit NEBNext® Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB #E8015) y el módulo de conversión Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB #E8020)? R: El protocolo se ha optimizado para insumos de 0,1 a 200 ng. P: ¿Qué tampones se recomiendan para el cizallamiento de ADN en los flujos de trabajo de NEBNext® Enzymatic Methyl-seq (EM-seq™)? R: Para usar con los kits NEBNext® Enzymatic Methyl-seq (NEB #E7120, #E8015), el ADN debe cizallarse en uno de los siguientes tampones: Tris-HCl 10 mM pH 7,5 o pH 8,0, TE 1X (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) o baja TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA). No recomendamos cizallar el ADN de entrada en 0,1X TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA) ni en agua. Al utilizar los módulos de conversión enzimática de metil-seq NEBNext (NEB n.° E7125, n.° E8020), el ADN no debe estar en un tampón que contenga EDTA antes de proceder con la reacción de oxidación. Por lo tanto, se recomienda cizallar el ADN en 10 mM Tris pH 8,0. Como alternativa, si se cizalla en 1X TE o baja TE, se requiere una limpieza de la columna o microesfera seguida de una elución en 10 mM Tris-HCl pH 8,0 o agua sin nucleasas. P: ¿Cuál es la concentración del adaptador EM-seq™ y la ¿Cebadores de doble índice únicos NEBNext® LV? R: El adaptador EM-seq es de 15 µM y los cebadores de doble índice únicos LV son de 10 µM. P: ¿Se puede almacenar el tampón TET2 "activo" durante más de 4 meses? R: No. El tampón TET2 "activo" debe desecharse después de 4 meses. P: ¿Se puede almacenar la T4-BGT recién diluida a largo plazo? R: No. La T4-BGT recién diluida debe desecharse inmediatamente después de su uso. P: ¿Cuál es el tamaño esperado de una biblioteca EM-seq™ v2 (NEB n.° E8015)? R: Las bibliotecas EM-seq v2 tienen aproximadamente 470-550 pb. P: ¿Cómo se deben secuenciar las bibliotecas EM-seq? R: Para la secuenciación de Illumina, la longitud de lectura se determina en última instancia por el tamaño de la biblioteca. Las bibliotecas de tamaño estándar se pueden secuenciar utilizando 2 lecturas de 76 bases o 2 lecturas de 100 bases. 2x Se pueden usar lecturas de 150 bases para bibliotecas de insertos más largas. P: ¿Cómo se deben analizar los datos de secuenciación de EM-seq™? R: Las bibliotecas EM-seq secuenciadas ofrecen el mismo resultado que las bibliotecas de bisulfito, con la citosina secuenciada como timina y 5mC o 5hmC secuenciados como citosina. Se pueden utilizar los procesos establecidos para el análisis de datos de bisulfito. También disponemos de un proceso de demostración y datos de ejemplo en la biblioteca de GitHub: https://github.com/nebiolabs/EM-seq/ P: ¿Se puede sustituir el adaptador EM-seq por otro adaptador? R: No se recomienda. El adaptador EM-seq se ha optimizado para su uso con el kit NEBNext Enzymatic Methyl-seq, y la sustitución por otro adaptador probablemente reducirá el rendimiento. P: ¿Las bibliotecas EM-seq son direccionales o no direccionales? R: Las bibliotecas EM-seq son direccionales. P: ¿Se pueden utilizar otros tampones en lugar del tampón de elución EM-seq suministrado? ¿Tampón? R: El tampón de elución EM-seq debe usarse cuando se indique en el protocolo, excepto en el caso de almacenamiento a largo plazo de bibliotecas EM-seq amplificadas por PCR, donde existen otras opciones (especificadas en el manual). P: ¿Cómo se preparan las bibliotecas EM-seq™ a partir de ADN libre de células (cfDNA)? R: El cfDNA no requiere fragmentación antes de la preparación de la biblioteca. Como se describe en el manual del producto, se pueden incorporar de 0,1 a 200 ng de cfDNA directamente al flujo de trabajo de EM-seq v2. Se puede añadir ADN de control precortado, lambda no metilada y pUC19 metilado con CpG al cfDNA antes del paso de preparación final. P: ¿Se pueden preparar bibliotecas a partir de ADN FFPE con el kit NEBNext® EM-seq v2? R: Sí, se pueden preparar bibliotecas utilizando de 0,1 a 200 ng de ADN FFPE. El ADN debe cortarse y las bibliotecas deben construirse según el EM-seq. Manual v2. Es posible que sea necesario optimizar los ciclos de PCR, pero recomendamos aumentarlos al menos en 2 ciclos. Tenga en cuenta que las bibliotecas preparadas a partir de ADN FFPE pueden tener mayores niveles de metilación en los contextos CHH y CHG. Sin embargo, el uso de un filtro 3C (disponible en la secuencia de Bismark) o similar reduce el nivel de metilación. El filtro elimina las lecturas que contienen 3 o más C consecutivas sin convertir en el contexto no CpG (es decir, CHG/CHH). P: ¿Qué niveles de conversión son típicos con los ADN de control suministrados en los kits EM-seq™ v2? R: El kit EM-seq v2 incluye dos controles de ADN: ADN Lambda sin metilar y ADN pUC19 metilado con CpG. Para entradas de 200 ng, observamos ≤ 0,5 % de metilación, y para entradas de 0,1 ng, observamos ≤ 1 % de metilación para la adición de lambda sin metilar, lo que indica una eficiencia de conversión del 99,5 %. 99%, respectivamente. Para pUC19 metilado con CpG, se detecta una metilación de CpG del 96-98% en el rango de entrada de 0,1-200 ng. Dado que el ADN de pUC19 está metilado enzimáticamente, es probable que no se alcance el 100% de metilación y que no todos los CpG estén metilados. P: ¿Se puede utilizar ADN fragmentado enzimáticamente como material de entrada para EM-seq™ v2? R: NEBNext UltraShear® es el único reactivo de fragmentación enzimática que recomendamos antes del flujo de trabajo de EM-Seq. No recomendamos otros métodos de fragmentación basados ​​en enzimas, ya que pueden afectar las marcas de metilación del ADN. Para usar NEBNext UltraShear con EM-seq v2, siga las recomendaciones del manual de UltraShear. P: ¿Hay hojas de muestra disponibles con los cebadores de doble índice únicos NEBNext® LV? R: Las hojas de muestra se pueden encontrar en la sección "Instrucciones de uso" de la página del producto. P: ¿Puedo... ¿Puedo usar NaOH (hidróxido de sodio) en lugar de formamida para desnaturalizar mi ADN antes de la reacción de desaminación? R: ¿Puedo usar NaOH (hidróxido de sodio) en lugar de formamida para desnaturalizar mi ADN antes de la reacción de desaminación? Sí, es posible usar NaOH, aunque se recomienda la formamida por su mayor facilidad de manejo. Si se usa NaOH, la concentración de la solución de NaOH debe ser precisa y el volumen añadido a la reacción debe ser exactamente de 4 μl. El NaOH es altamente corrosivo. Se deben seguir las normas de seguridad locales e institucionales al trabajar con NaOH. Si se realiza una dilución a partir de NaOH 2 N, asegúrese de que la solución madre tenga un pH mínimo de 12,5. Verifique el pH de la solución madre antes de usarla. Evite diluciones inexactas preparando un volumen de NaOH diluido lo suficientemente grande como para minimizar los errores de pipeteo. Recomendamos preparar al menos 1 ml. Prepare diluciones de NaOH frescas o almacene alícuotas diluidas a -20 °C hasta por 6 meses para evitar cambios en la concentración. El NaOH sólido es... Delicuescente (absorbe agua de la atmósfera). No se puede pesar con precisión. Por lo tanto, las soluciones preparadas a partir de pellets de NaOH deben titularse para alcanzar la concentración adecuada. P: ¿Son compatibles las bibliotecas de doble indexación con la secuenciación de extremo único? R: Sí, los oligos NEBNext para Illumina, incluidos los oligos de doble índice, son compatibles con la secuenciación de lectura única. Consulte la Guía general de secuenciación indexada de Illumina (versión actual) para obtener información sobre los flujos de trabajo de secuenciación de doble indexación en una celda de flujo de lectura única o en una celda de flujo de extremo emparejado. P: ¿Es normal que la solución de Fe(II) del producto EM-seq™ sea amarilla o se observe un cambio de color? R: Sí, se ha observado variación de color (de incolora a amarilla). Las pruebas no han mostrado ninguna diferencia en el rendimiento en función de esta variación. P: ¿Qué porcentaje de PhiX se necesita para las bibliotecas EM-seq™? R: Consulte las recomendaciones de Illumina®. Hemos tenido éxito con los siguientes porcentajes de PhiX: NovaSeq®: 5 % de PhiX NextSeq® 2000: 5 % PhiX NextSeq 500/550: 35 % PhiX MiSeq®: 5 % PhiX P: ¿Cómo se pueden añadir controles de adición pre-corte al ADNcf u otro ADN prefragmentado (amplicones, ADN digerido con enzimas de restricción, etc.) que se va a utilizar en el flujo de trabajo EM-seq™? R: Corte los controles lambda no metilado y pUC19 metilado con CpG para añadirlos al ADNcf u otro ADN prefragmentado (amplicones, ADN digerido con enzimas de restricción, etc.) de la siguiente manera: 10 µl de ADN control lambda no metilado (2 ng/µl) 10 µl de ADN control pUC19 metilado con CpG (0,1 ng/µl) 30 µl de Tris-HCl 15 mM, pH 8,0 Corte hasta un tamaño promedio de 350 pb. El ADN control. (ADN de control combinado pUC19 metilado con CpG (0,1 ng/µl) y ADN de control Lambda no metilado (2 ng/µl)) cortado en un volumen final de 50 µl equivale a una dilución de 1:5. Por lo tanto, para diluir aún más estos controles prefragmentados, por ejemplo a una dilución de 1:10, se requiere una dilución adicional de 1:2. Nota: Los ADN de control Lambda no metilado y pUC19 metilado con CpG se proporcionan en un tampón con Tris 1 mM a pH 7,5 y EDTA 0,1 mM. Es fundamental tener al menos 10 mM de Tris al fragmentar estos controles mediante métodos de corte mecánico como Covaris. El uso de un tampón con menos de 10 mM de Tris durante el corte da como resultado métricas de conversión alteradas, y las eficiencias de conversión evaluadas podrían no ser precisas. P: ¿Cómo se deben diluir los controles para aplicaciones que implican secuenciación superficial? R: Para Para aplicaciones donde se secuencia a una profundidad menor a 10 M de lecturas pareadas, recomendamos las siguientes diluciones de control según la cantidad de muestra de entrada: 200 ng: Sin dilución de ADN de control 10 ng: Dilución 1:10 de ADN de control 1 ng: Dilución 1:25 de ADN de control 0,1 ng: Dilución 1:25 de ADN de control Recomendamos tener al menos 5000 lecturas que se asignen al genoma Lambda no metilado y 500 lecturas que se asignen al genoma pUC19 metilado con CpG con una longitud de lectura de 76 bases para tener suficiente cobertura para determinar con seguridad las eficiencias de conversión. P: ¿Qué debo hacer si observo dímeros adaptadores en mis bibliotecas EM-seq™ v2? R: Ocasionalmente, puede observar dímeros adaptadores para muestras de entrada más bajas. Se puede realizar una limpieza adicional de 0,8X de las bibliotecas individuales o del grupo de bibliotecas. P: ¿Se puede usar la solución de Fe(II) recién diluida? ¿Almacenamiento a largo plazo? R: No. La solución de hierro recién diluida debe desecharse inmediatamente después de su uso. P: ¿El kit incluye cebadores? R: No. El kit se puede usar con los cebadores de doble índice únicos NEBNext LV. Para obtener una lista completa de cebadores de doble índice únicos de bajo volumen (LV), consulte la tercera columna de la Tabla de selección de oligonucleótidos multiplex NEBNext®. Para usar con los kits de preparación de bibliotecas NEBNext, consulte el manual del kit. Los manuales de los cebadores de doble índice únicos NEBNext LV también incluyen consejos para configurar las reacciones de ligación. Para obtener información sobre las opciones de balance de color, consulte el Selector de oligonucleótidos de índice NEBNext® para obtener combinaciones de códigos de barras válidas.