New England Biolabs, E8020S, módulo de conversión enzimática de metil-seq v2 NEBNext®

NEBNext Enzymatic Methyl-seq (EM-seq™) es una alternativa enzimática de alto rendimiento a la conversión con bisulfito para la identificación de 5mC y 5hmC. A diferencia de la conversión con bisulfito, este método altamente eficiente minimiza el daño al ADN, lo que resulta en una detección superior de citosinas metiladas con menos lecturas de secuenciación. Categorías relacionadas Conversión enzimática para análisis de metilación de ADN,, Análisis de metilomas,, Análisis de metilación de ADN, Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Instrumento NEBNext UltraShear® (M7634) o Covaris® y los tubos requeridos u otro equipo de fragmentación Tubos de tiras para PCR o placas de 96 pocillos Perlas de limpieza: Kit de reactivos SPRIselect (Beckman Coulter®, Inc. #B23317), perlas AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. #A63881) o fabricante de perlas preferido Hi-Di™ Formamida (Thermo Fisher Scientific® #4401457), Formamida (Sigma #F9037-100 ml), o NaOH 0,05 N. Se prefiere la formamida. Si usa NaOH, consulte las preguntas frecuentes asociadas con NEB #E8015. 80 % etanol 10 mM Tris-HCl pH 7,5 u 8,0 o TE bajo (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA) Agua libre de nucleasas Soporte/gradilla magnética, como NEBNext Magnetic Separation Rack (NEB n.º S1515) Bloque de enfriamiento metálico, como Diversified Biotech® (n.º CHAM-1000) Preguntas frecuentes sobre la máquina PCR P: ¿Cuál es la diferencia entre el kit NEBNext® Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB n.º E8015) y el módulo de conversión Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB n.º E8020)? R: El kit NEBNext Enzymatic Methyl-seq v2 contiene los componentes necesarios para crear una biblioteca EM-seq™, incluyendo reactivos para la preparación de extremos, la ligadura de adaptadores, la protección 5mC/5hmC, la desaminación de citosina y la mezcla maestra NEBNext Q5U para la amplificación. El kit EM-seq v2 se puede combinar con cualquiera de los cebadores de doble índice únicos de LV. El módulo de conversión Enzymatic Methyl-seq v2 no contiene reactivos para la preparación de bibliotecas, la amplificación, ni adaptadores ni cebadores. P: ¿Qué tipos de muestras se pueden procesar con el kit NEBNext® Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB n.° E8015) y el módulo de conversión Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB n.° E8020)? R: NEBNext Enzymatic Methyl-seq se puede utilizar con ADN genómico, ADN libre de células y ADN FFPE. P: ¿Cuáles son los insumos recomendados para el kit NEBNext® Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB n.° E8015) y el módulo de conversión Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB n.° E8020)? R: El protocolo se ha optimizado para insumos de 0,1 a 200 ng. P: ¿Qué tampones se recomiendan para el cizallamiento de ADN en los flujos de trabajo de NEBNext® Enzymatic Methyl-seq (EM-seq™)? R: Para usar con los kits de metil-seq enzimáticos NEBNext® (NEB n.° E7120, n.° E8015), el ADN debe cizallarse en uno de los siguientes tampones: Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 o 8,0, TE 1X (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) o TE bajo (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM). No se recomienda cizallar el ADN de entrada en TE 0,1X (Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM) ni en agua. Al usar los módulos de conversión de metil-seq enzimáticos NEBNext (NEB n.° E7125, n.° E8020), el ADN no debe estar en un tampón que contenga EDTA antes de proceder con la reacción de oxidación. Por lo tanto, se recomienda que el ADN se corte en 10 mM Tris pH 8.0. Alternativamente, si se corta en 1X TE o TE bajo, se requiere una limpieza de columna o microesferas seguida de una elución en 10 mM Tris-HCl pH 8.0 o agua libre de nucleasas. P: ¿Cuál es la concentración del adaptador EM-seq™ y los cebadores de índice dual únicos NEBNext® LV? R: El adaptador EM-seq es de 15 µM y los cebadores de índice dual únicos LV son de 10 µM. P: ¿Puede el tampón TET2 "activo" almacenarse más de 4 meses? R: No. El tampón TET2 "activo" debe desecharse después de 4 meses. P: ¿Puede el T4-BGT recién diluido almacenarse a largo plazo? R: No. El T4-BGT recién diluido debe desecharse inmediatamente después de su uso. P: ¿Cuáles son los niveles de conversión típicos de los ADN de control incluidos en los kits EM-seq™ v2? R: El kit EM-seq v2 incluye dos controles de ADN: ADN Lambda no metilado y ADN pUC19 metilado con CpG. Para entradas de 200 ng, se observa una metilación ≤ 0,5 %, y para entradas de 0,1 ng, se observa una metilación ≤ 1 % para la entrada de lambda no metilada, lo que indica una eficiencia de conversión del 99,5 % y el 99 %, respectivamente. Para pUC19 metilado con CpG, se detecta una metilación del 96-98 % en el rango de entrada de 0,1-200 ng. Dado que el ADN pUC19 está metilado enzimáticamente, es probable que no se alcance el 100 % de metilación y que no todos los CpG estén metilados. P: ¿Puedo usar NaOH (hidróxido de sodio) en lugar de formamida para desnaturalizar mi ADN antes de la reacción de desaminación? R: ¿Puedo usar NaOH (hidróxido de sodio) en lugar de formamida para desnaturalizar mi ADN antes de la reacción de desaminación? Sí, se puede usar NaOH, aunque se recomienda usar formamida por su mayor facilidad de manejo. Si se usa NaOH, la concentración de la solución debe ser precisa y el volumen añadido a la reacción debe ser exactamente de 4 μl. El NaOH es altamente corrosivo. Se deben seguir las normas de seguridad locales e institucionales al trabajar con NaOH. Si se realiza una dilución a partir de NaOH 2 N, asegúrese de que la solución madre tenga un pH mínimo de 12,5. Verifique el pH de la solución madre antes de usarla. Evite diluciones inexactas preparando un volumen de NaOH diluido lo suficientemente grande como para minimizar los errores de pipeteo. Recomendamos preparar al menos 1 ml. Prepare las diluciones de NaOH frescas o almacene las alícuotas diluidas a -20 °C hasta por 6 meses para evitar cambios en la concentración. El NaOH sólido es delicuescente (absorbe agua de la atmósfera). No se puede pesar con precisión. Por lo tanto, las soluciones preparadas a partir de pellets de NaOH deben titularse para alcanzar la concentración adecuada. P: ¿Es normal que la solución de Fe(II) del producto EM-seq™ sea amarilla o se observe un cambio de color? R: Sí, se ha observado variación de color (de incolora a amarilla). Las pruebas no han mostrado ninguna diferencia en el rendimiento en función de esta variación. P: ¿Cómo se pueden añadir controles de adición pre-corte al ADNcf u otro ADN prefragmentado (amplicones, ADN digerido con enzimas de restricción, etc.) que se incorporan al flujo de trabajo de EM-seq™? A: Corte los controles lambda no metilado y pUC19 metilado con CpG para agregarlos a cfDNA u otro ADN prefragmentado (amplicones, ADN digerido con enzimas de restricción, etc.) de la siguiente manera: 10 µl de ADN de control Lambda no metilado (2 ng/µl) 10 µl de ADN de control pUC19 metilado con CpG (0,1 ng/µl) 30 µl de Tris-HCl 15 mM, pH 8,0 Corte a un tamaño promedio de 350 pb El ADN de control (ADN de control pUC19 metilado con CpG combinado (0,1 ng/µl) y ADN de control Lambda no metilado (2 ng/µl)) cortado en un volumen final de 50 µl es equivalente a una dilución de 1:5. Por lo tanto, para diluir aún más estos controles prefragmentados, por ejemplo, a una dilución 1:10, se requiere una dilución adicional 1:2. Nota: Los ADN de control pUC19 metilado con Lambda y CpG se proporcionan en tampón con 1 mM de Tris a pH 7,5 y 0,1 mM de EDTA. Es fundamental tener al menos 10 mM de Tris al fragmentar estos controles mediante métodos de cizallamiento mecánico como Covaris. El uso de un tampón con menos de 10 mM de Tris durante el cizallamiento altera las métricas de conversión, y las eficiencias de conversión evaluadas podrían no ser precisas. P: ¿Cómo se deben diluir los controles para aplicaciones que implican secuenciación superficial? A: Para aplicaciones donde se secuencia a una profundidad menor a 10 M lecturas pareadas, recomendamos las siguientes diluciones de control basadas en la cantidad de entrada de muestra: 200 ng: Sin dilución de ADN de control 10 ng: dilución 1:10 de ADN de control 1 ng: dilución 1:25 de ADN de control 0,1 ng: dilución 1:25 de ADN de control Recomendamos tener al menos 5000 lecturas que se asignen al genoma Lambda no metilado y 500 lecturas que se asignen al genoma pUC19 metilado CpG con una longitud de lectura de 76 bases para tener suficiente cobertura para llamar con confianza a las eficiencias de conversión. P: ¿Se puede almacenar a largo plazo la solución de Fe(II) recién diluida? R: No. La solución de hierro recién diluida se debe desechar inmediatamente después de su uso.