New England Biolabs, E8021L, resina de amilosa

La resina de amilosa es una matriz de afinidad que se utiliza para aislar proteínas fusionadas a la proteína de unión a maltosa (MBP). Está diseñada para usarse en una columna de flujo por gravedad. Categorías relacionadas Purificación de amilosa (etiqueta MBP), Purificación por afinidad, Aplicaciones de purificación de proteínas Etiqueta de afinidad MBP, Purificación por afinidad y etiquetas de expresión Especificación Tampón de almacenamiento 20 % de etanol Capacidad de unión >4 mg MBP5*-paramiosina ΔSal proteína de fusión/ml de resina de amilosa. Puede regenerarse Sí Preguntas frecuentes P: Gran parte de mi proteína de fusión fluye a través de la columna de amilosa. ¿Hay algo que pueda hacer para mejorar la afinidad de mi fusión por la columna de amilosa? R: Es posible que una proteína de fusión MBP no se adhiera a la columna de amilosa debido a la presencia de algún factor en el extracto que interfiere con la unión o debido a una baja afinidad intrínseca. Los factores del extracto crudo que pueden interferir con la unión incluyen detergentes no iónicos y componentes celulares que se liberan durante métodos alternativos de lisis (tratamiento prolongado con lisozima o múltiples pases a través de una prensa francesa). Además, las células cultivadas en LB y medios similares tienen cantidades sustanciales de una amilasa que interfiere con la unión, presumiblemente al cortar la fusión de la columna o al liberar maltosa que eluye la fusión de la columna. Al incluir glucosa en el medio, se reprime la expresión de esta amilasa y se alivia el problema. Una baja afinidad intrínseca podría deberse a una interacción entre la proteína de interés y la MBP que bloquea o distorsiona el sitio de unión de la maltosa. Aunque esto puede ser inherente a la proteína de interés, a veces el problema puede aliviarse acortando o alargando el polipéptido que está fusionado a la MBP. P: ¿Cuántas veces puedo usar la columna de amilosa? R: La variable más importante para determinar la vida útil de la resina de amilosa es el tiempo que está en contacto con trazas de amilasa presentes en el extracto crudo. En condiciones normales (extracto crudo de 1 litro de células cultivadas en LB + glucosa al 0,2 %, columna de 15 ml), la columna pierde entre el 1 % y el 3 % de su capacidad de unión inicial cada vez que se usa. Si el rendimiento de la proteína de fusión en estas condiciones es de 40 mg, esto significa que después de 3 a 5 ejecuciones habría una disminución en el rendimiento. En la práctica, a menudo usamos una columna de 8 a 10 veces antes de notar una caída significativa en el rendimiento. P: ¿Qué se sabe sobre la unión en presencia de detergentes no iónicos? R: Algunas proteínas de fusión no se unen eficientemente (< 5 % de unión) en presencia de Triton X-100 al 0,2 % o Tween 20 al 0,25 %, mientras que otras fusiones no se ven afectadas. Para una fusión que no se une en Tween 20 al 0,25 %, diluir el Tween al 0,05 % restaura aproximadamente el 80 % de la unión. P: ¿Puedo sustituir un tampón o una concentración de sal diferente en el tampón de columna? R: Sí, se pueden usar tampones HEPES, MOPS y fosfato (a valores de pH de 6,5 a 8,5) en lugar de Tris-HCl en el tampón de columna con resultados similares. Las concentraciones de NaCl o KCl de 25 mM a 1 M también son compatibles con la purificación por afinidad. P: Veo mi proteína de fusión intacta mediante SDS-PAGE cuando analizo células hervidas en tampón de muestra, pero cuando compruebo el extracto crudo, la fusión se degrada. R: Para las fusiones expresadas en el citoplasma, en muchos casos la mayor parte de la degradación ocurre durante la cosecha y la lisis. La cosecha y la lisis rápidas de las células pueden ayudar. En otros casos, la degradación ocurre cuando la proteína de fusión se expone a proteasas periplásmicas o de la membrana externa. La mejor estrategia en ambos casos es utilizar un huésped deficiente en la(s) proteasa(s) responsable(s). P: Al analizar mi proteína de fusión purificada mediante SDS-PAGE, ¿por qué observo múltiples bandas en lugar de una sola con el peso molecular esperado? R: Existen dos posibles explicaciones para este resultado. La primera es que la proteína de fusión es inestable, lo que suele provocar degradación in vivo. En este caso, cabría esperar ver bandas de entre el tamaño de la MBP (42,5 kDa) y el tamaño esperado para la fusión completa, ya que los fragmentos más pequeños que la MBP no se unirían a la columna de afinidad. Una excepción sería si la proteína de fusión se descompone en la unión entre la MBP y la proteína de interés, y esta oligomeriza. En esta situación, la proteína de interés puede unirse a la proteína de fusión y, por lo tanto, puede aparecer una banda del tamaño de la proteína de interés incluso si es más pequeña que la MBP. La segunda explicación es que la proteína de interés se une de forma inespecífica a otras proteínas de E. coli; por ejemplo, tiene una superficie que se une a otras proteínas mediante interacciones electrostáticas o hidrofóbicas. En este caso, a veces se pueden utilizar modificaciones en el tampón de la columna para facilitar la eliminación de las proteínas que interactúan. Las interacciones electrostáticas se pueden debilitar añadiendo hasta 1 M de NaCl al tampón de la columna, y las interacciones hidrofóbicas se pueden debilitar reduciendo la sal a 25-50 mM de NaCl e incluyendo etanol o acetonitrilo al 5 % en el tampón de la columna. También se pueden utilizar detergentes no iónicos para debilitar las interacciones hidrofóbicas, pero pueden interferir con la afinidad de ciertas proteínas de fusión. P: ¿Puedo realizar una purificación por lotes utilizando la resina de amilosa? R: Sí, la purificación por lotes funciona bien, aunque es difícil eliminar todas las proteínas inespecíficas con la misma eficacia que en una columna debido al volumen incluido en la resina. La resina puede soportar la centrifugación a hasta 6000 x g. Un buen compromiso es cargar la resina en un modo de lote, incubando con agitación durante 2 horas o toda la noche, luego verterla en una columna para lavar y eluir. La dilución del extracto crudo puede no ser crítica para cargar la columna por el método de lote. P: ¿Se daña la resina de amilosa por el almacenamiento a -20 °C? R: Recomendamos que las perlas se almacenen a 4 °C y nunca se congelen. La resina se congelará a -20 °C, pero el rendimiento de la resina no se degrada con un ciclo de congelación/descongelación. La congelación del producto en una solución diferente a nuestra solución de almacenamiento (es decir, en ausencia de etanol al 20%) puede resultar en un rendimiento reducido/degradación de la resina, por lo que el cliente debe verificar el rendimiento funcional antes de su uso. P: ¿Qué columna de gravedad recomienda? R: Recomendamos la línea de columnas Econo de 2,5 cm (diámetro interno) de Bio-Rad o la Kontes Flex-Column. Los tamaños de columna (diámetro interno y longitud) se pueden aumentar o disminuir y deben basarse en la cantidad de resina necesaria para aislar la proteína de interés con rendimientos suficientes. P: ¿Se puede limpiar, almacenar y volver a utilizar la resina de amilosa? R: Sí, la resina se puede reutilizar de tres a cinco veces cuando se limpia y se almacena con la siguiente secuencia de lavados: Agua: 3 volúmenes de columna SDS al 0,1 % en agua: 3 volúmenes de columna Agua: 3 volúmenes de columna Tampón de columna: 3 volúmenes de columna (para uso a corto plazo) o etanol al 20 %: 3 volúmenes de columna (para almacenamiento a largo plazo) Recomendamos realizar el protocolo de limpieza descrito anteriormente a temperatura ambiente para evitar la precipitación de SDS a temperaturas más bajas. Tras el uso repetido de resina de amilosa, la amilasa en el extracto de E. coli disminuye la capacidad de unión de la columna; por lo tanto, se recomienda limpiar y almacenar la columna, como se describe anteriormente, inmediatamente después de cada uso. P: ¿Es posible purificar las fusiones de MBP en presencia de desnaturalizantes como urea o clorhidrato de guanidina? R: No. La afinidad de la MBP por la amilosa y la maltosa depende de los enlaces de hidrógeno, que a su vez están determinados por la estructura tridimensional de la proteína. Los agentes que interfieren con los enlaces de hidrógeno o la estructura de la proteína también interfieren en la unión.