New England Biolabs, E8022L, Resina de amilosa de alto flujo

Amylose Resin High Flow es una matriz de afinidad reticulada que se utiliza para el aislamiento de proteínas fusionadas a la proteína de unión a maltosa (MBP). Esta matriz rígida se puede utilizar en sistemas de cromatografía automatizados. Categorías relacionadas Purificación de amilosa (etiqueta MBP),, Purificación por afinidad,, Aplicaciones de purificación de proteínas Etiqueta de afinidad MBP,, Purificación por afinidad y etiquetas de expresión,, Purificación de proteínas, Especificación Tampón de almacenamiento 20% Etanol Capacidad de unión >4 mg Proteína de fusión MBP5* -paramiosina δSal / ml de resina de alto flujo de amilosa. Se puede regenerar Sí Preguntas frecuentes P: ¿Qué columna de gravedad recomiendan? R: Recomendamos la línea de columnas Econo de 2,5 cm (diámetro interno) de Bio-Rad o la Kontes Flex-Column. Los tamaños de columna (diámetro interno y longitud) se pueden aumentar o reducir y deben basarse en la cantidad de resina necesaria para aislar la proteína de interés con rendimientos suficientes. P: Gran parte de mi proteína de fusión fluye a través de la columna de amilosa. ¿Puedo hacer algo para mejorar la afinidad de mi proteína de fusión por la columna de amilosa? R: Una proteína de fusión MBP podría no adherirse a la columna de amilosa debido a la presencia de algún factor en el extracto que interfiere con la unión, o debido a una baja afinidad intrínseca. Los factores en el extracto crudo que pueden interferir con la unión incluyen detergentes no iónicos y componentes celulares que se liberan durante métodos alternativos de lisis (tratamiento prolongado con lisozima o múltiples pases a través de una prensa francesa). Además, las células cultivadas en medios LB y similares contienen cantidades sustanciales de una amilasa que interfiere con la unión, presumiblemente al cortar la fusión de la columna o al liberar maltosa que la eluye. Al incluir glucosa en el medio, se reprime la expresión de esta amilasa y se alivia el problema. Una baja afinidad intrínseca podría deberse a una interacción entre la proteína de interés y la MBP que bloquea o distorsiona el sitio de unión a la maltosa. Aunque esto puede ser inherente a la proteína de interés, a veces el problema se puede solucionar acortando o alargando el polipéptido fusionado a la MBP. P: ¿Cuántas veces puedo usar la columna de amilosa? R: La variable más importante para determinar la vida útil de la resina de amilosa es el tiempo que está en contacto con trazas de amilasa presentes en el extracto crudo. En condiciones normales (extracto crudo de 1 litro de células cultivadas en LB + 0,2 % de glucosa, columna de 15 ml), la columna pierde entre el 1 % y el 3 % de su capacidad de unión inicial cada vez que se usa. Si el rendimiento de la proteína de fusión en estas condiciones es de 40 mg, esto significa que después de 3 a 5 ciclos se produciría una disminución en el rendimiento. En la práctica, solemos usar una columna entre 8 y 10 veces antes de notar una disminución significativa en el rendimiento. P: ¿Qué se sabe sobre la unión en presencia de detergentes no iónicos? R: Algunas proteínas de fusión no se unen eficazmente (<5 % de unión) en presencia de Triton X-100 al 0,2 % o Tween 20 al 0,25 %, mientras que otras fusiones no se ven afectadas. En el caso de una fusión que no se une en Tween 20 al 0,25 %, la dilución del Tween al 0,05 % restaura aproximadamente el 80 % de la unión. P: ¿Puedo sustituir el tampón o la concentración de sal en el tampón de columna? R: Sí, se pueden utilizar tampones HEPES, MOPS y fosfato (a valores de pH de 6,5 a 8,5) en lugar de Tris-HCl en el tampón de columna con resultados similares. Las concentraciones de NaCl o KCl de 25 mM a 1 M también son compatibles con la purificación por afinidad. P: Veo mi proteína de fusión intacta por SDS-PAGE cuando analizo células hervidas en el tampón de muestra, pero cuando reviso el extracto crudo, la fusión está degradada. R: Para las fusiones expresadas en el citoplasma, en muchos casos la mayor parte de la degradación ocurre durante la cosecha y la lisis. La cosecha rápida y la lisis de las células rápidamente pueden ayudar. En otros casos, la degradación ocurre cuando la proteína de fusión se expone a proteasas periplásmicas o de la membrana externa. La mejor estrategia en cualquier caso es usar un huésped que sea deficiente en la(s) proteasa(s) agresora(s). P: Cuando analizo mi proteína de fusión purificada en SDS-PAGE, ¿por qué veo múltiples bandas en lugar de una sola banda del peso molecular esperado? R: Hay dos posibles explicaciones para este resultado. La primera es que la proteína de fusión es inestable, lo que suele provocar degradación in vivo. En este caso, se esperaría ver bandas entre el tamaño de MBP (42,5 kDa) y el tamaño esperado para la fusión de longitud completa, ya que los fragmentos más pequeños que MBP no se unirían a la columna de afinidad. Una excepción sería si la proteína de fusión se descompone en la unión entre MBP y la proteína de interés, y la proteína de interés oligomeriza. En esta situación, la proteína de interés puede unirse a la proteína de fusión y, por lo tanto, puede aparecer una banda del tamaño de la proteína de interés incluso si es más pequeña que MBP. La segunda explicación es que la proteína de interés se une de forma no específica a otras proteínas de E. coli, por ejemplo, tiene una superficie que se une a otras proteínas mediante interacciones electrostáticas o hidrofóbicas. En este caso, a veces se pueden utilizar modificaciones en el tampón de la columna para ayudar a eliminar las proteínas interactuantes. Las interacciones electrostáticas se pueden debilitar añadiendo hasta 1 M de NaCl al tampón de la columna, y las interacciones hidrófobas se pueden debilitar reduciendo la sal a 25-50 mM de NaCl e incluyendo etanol o acetonitrilo al 5 % en el tampón. También se pueden utilizar detergentes no iónicos para debilitar las interacciones hidrófobas, pero pueden interferir con la afinidad de ciertas proteínas de fusión. P: ¿Puedo realizar una purificación por lotes con la resina de amilosa? R: Sí, la purificación por lotes funciona bien, aunque es difícil eliminar todas las proteínas inespecíficas con la misma eficacia que en una columna debido al volumen incluido en la resina. La resina puede soportar la centrifugación a hasta 6000 x g. Una buena solución es cargar la resina en modo por lotes, incubándola con agitación durante 2 horas o toda la noche, y luego verterla en una columna para lavarla y eluirla. La dilución del extracto crudo puede no ser crítica para cargar la columna mediante el método por lotes. P: ¿La resina de amilosa se daña por el almacenamiento a -20 °C? R: Recomendamos que las perlas se almacenen a 4 °C y nunca se congelen. La resina se congelará a -20 °C, pero el rendimiento de la resina no se degrada con un ciclo de congelación/descongelación. Congelar el producto en una solución diferente a nuestra solución de almacenamiento (es decir, en ausencia de etanol al 20 %) puede reducir el rendimiento/degradación de la resina, por lo que el cliente debe verificar el rendimiento funcional antes de su uso. P: ¿Cuál es el caudal y la presión máxima recomendados para Amylose Resin High Flow una vez empaquetada en una columna? R: Amylose Resin High Flow tiene los siguientes caudales y parámetros de presión recomendados: 2,5 a 5 mL/min a <0,1 MPa utilizando tampones con la misma viscosidad que el agua. P: ¿Se pueden purificar las fusiones de MBP en presencia de desnaturalizantes como urea o guanidina-HCl? R: No, la afinidad de la MBP por la amilosa y la maltosa depende de los enlaces de hidrógeno, que a su vez están determinados por la estructura tridimensional de la proteína. Los agentes que interfieren con los enlaces de hidrógeno o la estructura de la proteína también interfieren en la unión.