New England Biolabs, E8101S, Ph.D.™ Sistema de clonación de visualización de péptidos

El sistema de clonación Ph.D.™ Peptide Display contiene el vector M13KE, el vector progenitor de las bibliotecas Ph.D. de NEB. El cebador de extensión M13 incluido se utiliza para crear un dúplex de ADN a partir de un oligonucleótido sintético proporcionado por el usuario, con o sin bases aleatorias. El sistema de visualización se utiliza mejor para mostrar péptidos pequeños, es decir, secuencias de 50 aminoácidos o menos. Categorías relacionadas: Aplicaciones de visualización en fagos. Preguntas frecuentes sobre visualización en fagos. P: ¿Se pueden clonar bibliotecas de ADNc en M13KE? R: En general, M13 no es susceptible a la expresión de ADNc debido al requisito de expresión en marco entre la secuencia líder (necesaria para la secreción) y el extremo N-terminal de la proteína de cubierta pIII o pVIII. La consecuencia de este requisito es que un inserto debe estar en el marco de lectura correcto en ambos extremos (p = 1/9) y no contener codones de terminación en marco (p = [61/64] n/3, donde n es la longitud promedio del inserto en pares de bases) para que la secuencia proteica correspondiente se fusione correctamente a la proteína de la cubierta. Esto resulta en un número extremadamente pequeño de clones productivos en las bibliotecas de ADNc de M13. Por el contrario, la expresión de insertos de ADNc como fusiones de proteína de la cubierta C-terminal es posible en los sistemas de visualización de fagos T7. P: ¿Puedo mostrar fragmentos de anticuerpos o proteínas en el extremo N-terminal de la proteína de la cubierta pIII con M13KE? R: En el sistema de visualización de fagos Ph.D.™, cada copia de pIII muestra la secuencia peptídica codificada. Por esta razón, cualquier inserto que interfiera con el ensamblaje de partículas de fago o la función de pIII no producirá fagos viables. Normalmente, los sistemas de fagémidos, donde un fago auxiliar proporciona una segunda copia de la proteína de la cubierta nativa, se utilizan para mostrar insertos del tamaño de una proteína en M13. Consideramos que el rango máximo para este sistema es de 25 a 50 aminoácidos. Hasta cierto punto, también depende de la secuencia y la estructura secundaria. P: ¿Cuáles son las diferencias entre la visualización de pIII y pVIII? R: Los sistemas de visualización de fagos filamentosos se basan generalmente en fusiones N-terminales con las proteínas de la cubierta pIII o pVIII. pIII está presente en 5 copias por virión, de las cuales las 5 pueden fusionarse a péptidos cortos sin interferir con la infectividad del fago. La proteína de la cubierta principal, pVIII, está presente en ~2700 copias por virión, de las cuales ~10% puede fusionarse de forma fiable a péptidos o proteínas. Como resultado, los péptidos expresados ​​como fusiones pIII están presentes en baja valencia (1-5 copias por virión), mientras que las fusiones pVIII están presentes en alta valencia (~200 copias por virión). El efecto de mayor avidez de la visualización pVIII de alta valencia permite la selección de ligandos de muy baja afinidad, mientras que la visualización pIII de baja valencia limita la selección a ligandos de mayor afinidad. El sistema de clonación Phage Display™ está diseñado para realizar fusiones pIII (5 copias del péptido por virión). Las bibliotecas prefabricadas de NEB son el formato de visualización pIII pentavalente. P: ¿El sistema de clonación Phage Display™ incluye un vector de ADN bicatenario? R: Sí, M13KE se suministra en forma RF, o bicatenaria, en #E8101S que puede usarse directamente en la digestión de restricción. El ADN M13 monocatenario puede obtenerse mediante la precipitación con PEG/NaCl de partículas de fago de sobrenadantes de cultivo infectados. El ADN bicatenario se purifica directamente de las células infectadas. Un producto relacionado es el fago M13KE (#N0316S). Consulte el Manual de Visualización de Fagos Ph.D.™ para conocer los protocolos generales de M13. P: ¿Qué tipo de cepa debo utilizar con el Sistema de Clonación Ph.D.™? R: Cualquier cepa robusta F' o de E. coli macho se puede utilizar con M13. Preferimos ER2738 (NEB #E4104S) o NEB Turbo (NEB #C2984). Las células se pueden hacer competentes o adquirir de esa manera. Para las bibliotecas más complejas, se deben utilizar células electrocompetentes (eficacia ≥10⁻¹ transformantes por µg de M13). Consulte nuestro protocolo para crear células electrocompetentes en el manual de Visualización de Fagos Ph.D.™ o adquiera células electrocompetentes de la línea NEB. P: He realizado todos los pasos estándar de resolución de problemas para mi clonación y transfección, ¿y sigo sin obtener el clon deseado en M13KE? R: Asegúrese de que la secuencia líder pIII esté intacta y en el mismo marco de lectura que la proteína de la cubierta pIII en su diseño (consulte también la pregunta frecuente sobre ADNc n.° 1). Si el marco de lectura es correcto, el inserto podría no permitir la producción de fagos viables debido a problemas con la exportación al periplasma celular o con la función de la proteína de la cubierta pIII tras el ensamblaje del fago. Se sabe que los insertos de más de 25-50 aminoácidos y aquellos con cisteínas N-terminales o residuos con carga positiva son problemáticos. Estos problemas se pueden investigar subclonando el inserto en otro vector con sitios KpnI/EagI. Por ejemplo, intente clonar el inserto en pMAL pIII (n.° N8101S) para ver si la fusión inserto-MBP se puede producir y exportar al periplasma. P: ¿Dónde puedo encontrar la secuencia genómica completa del vector parental, M13KE, utilizado para clonar las bibliotecas de visualización de péptidos Ph.D.? R: La página de la herramienta Secuencias y Mapas de ADN contiene la secuencia de nucleótidos en varios formatos, así como un mapa de M13KE. Nota: El NEB n.° E8101S contiene ADN M13KE bicatenario (20 µg), también conocido como forma replicativa (RF).