New England Biolabs, E8111L, Ph.D.™-12 Biblioteca de péptidos de presentación en fagos

La biblioteca de péptidos Ph.D.-12™ Phage Display contiene un solo tubo de la biblioteca de fagos Ph.D.-12. La biblioteca Ph.D.-12 es una biblioteca combinatoria de péptidos aleatorios de 12 meros fusionados a una proteína de cubierta menor (pIII) del fago M13. El péptido mostrado se expresa en el extremo N-terminal de pIII. La biblioteca consta de aproximadamente 10 Categorías relacionadas Aplicaciones de visualización de fagos Preguntas frecuentes sobre visualización de fagos P: ¿Cuál de las tres bibliotecas listas para usar debería elegir? R: Las tres bibliotecas listas para usar (Ph.D.-7, Ph.D-12 y Ph.D-C7C) pueden contener aglutinantes para una diana determinada. La elección de la biblioteca no depende del tipo de diana ni de la aplicación posterior. Por este motivo, recomendamos que la mayoría de los clientes comiencen con cualquiera de las dos bibliotecas lineales, Ph.D-7 o Ph.D-12. La excepción es cuando se requiere una estructura en bucle para la aplicación, en cuyo caso se recomienda la biblioteca Ph.D.-C7C con bucle disulfuro. P: ¿Qué bibliotecas de péptidos están disponibles para usar con Ph.D.™ Phage Display? R: NEB ofrece tres bibliotecas de péptidos aleatorios preconfiguradas, así como el vector de clonación M13KE (NEB n.° E8101S) para la construcción de bibliotecas personalizadas. Las bibliotecas preconfiguradas consisten en bibliotecas de heptapéptidos lineales (biblioteca Ph.D.™-7, NEB n.° E8102L) y dodecapéptidos (biblioteca Ph.D.™-12, NEB n.° E8111L), así como una biblioteca de heptapéptidos con restricción disulfuro (biblioteca Ph.D.™-C7C, NEB n.° E8121L). Ph.D.™ es una marca registrada de New England Biolabs, Inc. P: Estoy usando Ph.D.™ Phage Display y el título del fago amplificado es bajo. R: Para que el fago M13 se amplifique eficientemente, es fundamental que los cultivos estén bien aireados y que se infecten en las primeras etapas de su crecimiento. Recomendamos la amplificación en cultivos de 20 mL en matraces Erlenmeyer de 250 mL, en un agitador a 250 rpm. La amplificación en recipientes más pequeños, como tubos cónicos de 50 mL, dará como resultado rendimientos mucho menores del fago amplificado. El fago M13 debe añadirse a un cultivo logarítmico temprano, A600 < 0,01, o a una dilución 1:100 de un cultivo de la noche anterior. El rendimiento del fago amplificado es máximo después de 4,5-5 horas a 37 °C; Una incubación más prolongada puede provocar deleciones y no se recomienda. Si se realiza una elución inespecífica con tampón de glicina a pH 2,2, el fago eluido debe neutralizarse como se describe en el manual antes de la amplificación. P: Estoy utilizando Ph.D.™ Phage Display y las plantillas de ADN del fago no producen una secuencia legible. R: El protocolo de Purificación Rápida de Plantillas de ADN Monocatenario para Reacciones de Secuenciación debería proporcionar una plantilla monocatenaria con la pureza suficiente para las reacciones de secuenciación. El procedimiento debe seguirse exactamente como se describe en el manual: la precipitación prolongada con etanol, la precipitación a 20 °C o la centrifugación durante más de 10 minutos provocarán la coprecipitación de la sal y las proteínas del fago, lo que inhibirá la secuenciación. Además, es fundamental que el sedimento del fago esté completamente suspendido en el tampón de yoduro antes de añadir etanol. Si los problemas persisten o se utiliza otro método de secuenciación, se puede añadir un paso de extracción con fenol:cloroformo: tras la suspensión en tampón de yoduro, añadir 2 volúmenes de TE, extraer una vez con fenol:cloroformo (1:1) y otra con cloroformo, y precipitar con etanol. 5 µL de plantilla suspendida (aproximadamente 0,5 µg) deberían ser suficientes para la secuenciación; la cuantificación debe confirmarse mediante electroforesis en gel de agarosa utilizando 0,5 µg de ADN monocatenario M13 (NEB n.º N4040S) como estándar. P: Estoy utilizando Phage Display de Ph.D.™ y las plantillas de secuenciación no se ejecutan donde deberían en un gel. R: Las plantillas de secuenciación preparadas con el método del manual son monocatenarias (aprox. 7250 nucleótidos) y, como resultado, no se alinearán con marcadores bicatenarios de la misma longitud. El tamaño aparente variará según el voltaje aplicado, la concentración de etidio y agarosa en el gel, y si se utiliza TBE o TAE como tampón de ejecución. Recomendamos encarecidamente utilizar ADN M13 monocatenario (p. ej., M13mp18 monocatenario, NEB n.º N4040) como marcador. P: Estoy utilizando Ph.D.™ Phage Display y, tras 4 o más rondas de cribado, todos los clones son fagos de tipo salvaje (placas blancas). R: En una ronda típica de biocribado, se hacen reaccionar ~2 x 10¹¹ fagos de entrada con el objetivo, y se eluyen entre 10³ y 10¹¹ fagos totales tras el lavado. Esto corresponde a un enriquecimiento de 10¹¹ a 10¹¹ por ronda. Dado que la biblioteca contiene ~2 x 10¹¹ clones diferentes, en teoría, el conjunto de fagos eluidos debería estar completamente enriquecido a favor de las secuencias de unión tras solo 2 o 3 rondas. Una vez alcanzado este punto, las rondas posteriores de amplificación y cribado solo seleccionarán fagos con una ventaja de crecimiento sobre el fago de la biblioteca. Por ejemplo, niveles minúsculos de fago silvestre ambiental contaminante (menos de una parte por mil millones) superarán por completo el conjunto si se realizan demasiadas rondas de amplificación, independientemente de la intensidad de la selección in vitro. P: Al realizar un experimento con Ph.D.™ Phage Display, la prueba ELISA indica que la unión de fondo a la placa es tan alta como la unión a la diana. R: Si se realiza el cribado contra una placa de poliestireno recubierta con la diana (método de recubrimiento directo), es posible seleccionar inadvertidamente péptidos que se unen específicamente a la superficie de poliestireno (véase Adey, NB et al. (1995) Gene 156, 27-31). Estos péptidos producirán señales ELISA idénticas en presencia y ausencia de la diana, ya que la placa ELISA también está hecha de poliestireno. Estos "ligantes plásticos" suelen ser ricos en residuos aromáticos (Phe, Tyr, Trp, His), que a menudo se alternan (la secuencia FHWTWYW es un ligante plástico descubierto y caracterizado en NEB). La selección de ligantes plásticos suele ocurrir en ausencia de una fuerte preferencia por las secuencias de péptidos presentes en la biblioteca: otras bibliotecas pueden producir las secuencias específicas de la diana deseada. La selección de péptidos específicos de poliestireno puede evitarse utilizando el protocolo de captura de microesferas descrito en el Manual. El fago reacciona con la diana en solución y los complejos fago-diana se capturan en microesferas que se unen específicamente a la diana (proteína A-agarosa para dianas de anticuerpos, glutatión-agarosa para fusiones de GST, etc.). El fago no unido se elimina lavando a fondo las microesferas en un tubo de microcentrífuga. A diferencia del poliestireno, ni las microesferas (normalmente de agarosa reticulada) ni el tubo de microcentrífuga (de polipropileno) suelen seleccionar secuencias peptídicas específicas de la biblioteca, aunque las especies conjugadas con las microesferas (proteína A, glutatión, etc.) sí podrían hacerlo. Para evitar la selección de ligandos específicos de las microesferas, sugerimos alternar rondas entre diferentes microesferas específicas para la diana (p. ej., microesferas de proteína A para las rondas 1 y 3, microesferas de proteína G para la ronda 2 para dianas de anticuerpos), o añadir un paso de cribado sustractivo, comenzando con la ronda 2, en el que el grupo de fagos se hace reaccionar primero con las microesferas solas (sin diana), se descartan las microesferas y el sobrenadante de este paso reacciona con la diana. P: Al utilizar Ph.D.™ Phage Display, el cribado produjo una secuencia consenso, pero no una señal ELISA. R: Al caracterizar clones de fagos mediante el protocolo ELISA del manual, es difícil añadir más de 10¹2 viriones por pocillo de 100 µL. Esto corresponde a una concentración de fago de tan solo 16 nM. A esta concentración, solo se puede observar una señal ELISA inequívocamente positiva si la afinidad de unión es micromolar o superior. La naturaleza iterativa de la selección de fagos permite la identificación de ligandos con un amplio rango de afinidades, desde subnanomolares hasta 1 milimolar, por lo que los ligandos con menor afinidad no mostrarán una señal ELISA positiva. En este caso, es necesario aumentar la concentración del ligando seleccionado, ya sea sintetizando un péptido correspondiente a la secuencia seleccionada (asegúrese de incluir la secuencia espaciadora GGGS en el extremo C-terminal y amidar el carboxilato C-terminal si es posible), o expresando la secuencia seleccionada como una fusión N-terminal a una proteína más pequeña. Como alternativa, se puede realizar una ELISA tipo sándwich en la que se inmoviliza el fago seleccionado y se aplica un exceso de proteína diana en la fase líquida. Este procedimiento requiere un anticuerpo contra la proteína diana o algún otro medio para detectar la proteína diana unida. Recubra los pocillos durante la noche con anticuerpo anti-M13 (sin HRP), lave y añada diluciones seriadas de cada clon de fago (un clon por fila). Después de 1 hora, lave el fago no unido y añada un exceso de proteína diana (0,1 - 1 µM) en TBST. Incube de 1 a 2 horas a temperatura ambiente, lave la proteína diana no unida y detecte la diana unida con un anticuerpo ligado a enzimas. P: Estoy usando Ph.D.™ Phage Display y el experimento de control con estreptavidina no produjo la secuencia consenso HPQ. R: Si utilizó glicina a pH bajo en lugar de biotina para eluir su fago, probablemente no obtendrá una secuencia consenso HPQ. Debido a la relativamente baja afinidad de la interacción péptido-estreptavidina, la elución inespecífica es incapaz de enriquecer selectivamente para péptidos que contienen HPQ. Los péptidos que contienen HPQ pueden eluirse competitivamente utilizando el ligando natural biotina. Si usó biotina para eluir y aún así no obtuvo una secuencia de consenso, la explicación más probable es que no realizó lavados lo suficientemente rigurosos. Al lavar, vierta el tampón de lavado en la placa desde una botella (no lo pipetee suavemente) y agítelo durante unos 10 segundos cada vez. El número de fagos que eluya después de la primera ronda de biopanning debe estar en el rango de 103 - 107 (más cerca de 103 para un pocillo de ELISA y más cerca de 107 para pocillos más grandes). Si está eluyendo más fagos, no está lavando lo suficientemente bien y, como resultado, no está obteniendo suficiente enriquecimiento. También puede ser útil añadir 0,1 µg/ml de estreptavidina al tampón de bloqueo para complejar la biotina contaminante de la BSA, que de otro modo podría complejar la estreptavidina de la placa durante el paso de bloqueo. P: ¿Se puede utilizar una cepa bacteriana diferente con el sistema Ph.D.™ Phage Display? R: En teoría, otras cepas F+ que contienen la mutación supresora supE (como XL1-Blue y DH5αF´) deberían funcionar con nuestro sistema de visualización de fagos. Sin embargo, no hemos probado estas cepas con nuestras bibliotecas y desconocemos si se producirán efectos sutiles en la expresión o el transporte de ciertos péptidos fuera de la célula. Dado que las bibliotecas Ph.D. se crean en ER2738 (NEB n.° E4104S), sabemos que todos los péptidos de las bibliotecas se pueden expresar correctamente en esta cepa. Por lo tanto, recomendamos esta cepa sobre cualquier otra. P: ¿Dónde puedo encontrar referencias sobre las bibliotecas de visualización de fagos Ph.D.™? R: Constantemente se publican nuevas publicaciones. Busque en la bibliografía "peptide phage display" con o sin la aplicación que prefiera y encontrará referencias para nuestras bibliotecas. Además, consulte las referencias para aplicaciones específicas, así como los enlaces a publicaciones fundamentales, aquí. Además, contamos con una base de datos con función de búsqueda de referencias más recientes, accesible desde la parte inferior derecha de nuestra página de inicio a través de Publicaciones. P: ¿Cuál es la secuencia pIII para un clon sin inserto? ¿Qué hay en el extremo N-terminal de un clon PhD? R: El marco de lectura abierto para la secuencia gIII nativa comienza con 5'-GTG AAA AAA TTA... (véase el inicio de GTG en la revisión Kozak, M. (1999) Gene 234, 187-208 Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes; van Wezenbeek, PMGF et al (1980) Gene 129-148). El extremo N-terminal de pIII incluye una secuencia líder necesaria para procesar la proteína recién traducida en la célula. El péptido maduro, tal como se muestra en el fago M13, se ha escindido en el sitio de la peptidasa líder. Tenga en cuenta que la región aleatoria estará en el mismo marco de lectura que la secuencia líder. Traducción de gIII para M13KE o un clon sin inserto: MKKLLFAIPLVVPFYSHS // AETVES Traducción de gIII para un clon PhD (X es una posición aleatoria): Clon Ph.D.-12 n.º E8210S, E8111L MKKLLFAIPLVVPFYSHS // X12-GGGS-AETVES…pIII→ Clon Ph.D.-7 n.º E8211S MKKLLFAIPLVVPFYSHS // X7-GGGS-AETVES…pIII→ Clon Ph.D.-C7C n.º E8212S MKKLLFAIPLVVPFYSHS // ACX7C-GGGS-AETVES…pIII→ Una nota adicional: un clon Ph.D. El clon tendrá 5 copias de la misma proteína pIII, es decir, (Ph.D.-7) X7-GGGS-AETVES…, en un extremo de la partícula cilíndrica. // indica el sitio de escisión de la peptidasa líder P: ¿Cómo se clonan las Phage Display Libraries de PhD? R: La siguiente figura muestra el esquema de clonación. Consulte nuestro manual PhD Cloning System NEB #E8101S para obtener más detalles. Véase también Noren, CJ y Nore, KA 2001 Methods 23, 169-178. doi:10.1006/meth.2000.1118 P: ¿Dónde puedo encontrar la secuencia completa del genoma del vector parental, M13KE, utilizado para clonar las Phage Display Libraries de Ph.D.? R: La página de la herramienta DNA Sequences and Maps Tool tiene la secuencia de nucleótidos en varios formatos, así como un mapa de M13KE. Nota: NEB #E8101S contiene ADN bicatenario, también conocido como forma replicativa (RF), M13KE (20 ug).