New England Biolabs, E8210S, Ph.D.-12 Kit de biblioteca de péptidos de presentación en fagos v2

El kit Ph.D.-12™ Phage Display Peptide Library Kit v2 contiene la Phage Display Peptide Library, un anticuerpo monoclonal de ratón DYKDDDDK y perlas magnéticas de proteína G para un experimento de control de panning, y suficiente cebador de secuenciación -96gIII para >50 reacciones de secuenciación. La Phage Display Peptide Library es una biblioteca combinatoria de péptidos aleatorios de 12 meros fusionados al extremo N-terminal de una proteína de cubierta menor (pIII) del fago M13. La biblioteca consta de ~10 Categorías relacionadas Herramientas de proteínas,, Aplicaciones de visualización en fagos Visualización en fagos,, Herramientas de análisis de proteínas Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre los kits de visualización en fagos original y la versión 2 (v2)? R: Las diferencias exactas entre la versión original y los kits v2 se describen en la siguiente tabla. Las bibliotecas Ph.D.-7, Ph.D.-12 y Ph.D.-C7C no han cambiado, y sus números de producto siguen siendo los mismos. Los nuevos kits v2 incluyen un experimento de control de cribado en fase solución optimizado y modernizado que requiere menos pasos experimentales, mientras que los kits originales recomendaban un experimento de cribado superficial. Además, el cebador de secuenciación -96 gIII ahora se suministra a una concentración 10 veces mayor (10 pmol/ml) para alinearse mejor con las pautas de envío de los centros de secuenciación comerciales. El cebador de secuenciación -28 gIII se ha eliminado porque la ubicación de hibridación está demasiado cerca de la región aleatoria Ph.D. para ser útil en las tecnologías de secuenciación modernas. Componentes del kit original Nombre N.° de producto Cantidad Concentración Ph.D. Biblioteca de péptidos de visualización de fagos E8102 o E8111 o E8121 1 x 0,1 ml 1 x 1013 pfu/ml E. coli K12 ER2738 E4104 1 x 0,2 ml Cebador de secuenciación -96 gIII S1259 100 pmol 1 pmol/ml Cebador de secuenciación -28 gIII S1258 100 pmol 1 pmol/ml Estreptavidina N7023 1 x 1,5 mg Biotina N7024 1 x 0,1 ml 10 mM Nuevo kit v2 Componentes Nombre Producto # Cantidad Concentración Ph.D. Biblioteca de péptidos de visualización de fagos E8102 o E8111 o E8121 1 x 0,1 ml 1 x 1013 pfu/ml E. coli K12 ER2738 E4104 1 x 0,2 ml Cebador de secuenciación -96 gIII S1259 500 pmol 10 pmol/ml mAb de ratón DYKDDDDK E8004 1 x 0,015 ml Perlas magnéticas de proteína G S1430 1 x 0,15 ml Método del kit original Nuevo método del kit v2 Solución de limpieza de superficies Limpieza de fases Superficie de poliestireno de captura (pocillo o placa de Petri) Perlas magnéticas de proteína G (n.º S1430) Preparar la superficie de captura Recubrimiento del objetivo durante la noche (estreptavidina, n.º N7023), bloqueo de 2 h Ninguno Unión (paso de selección) Aplicar doctorado biblioteca a superficie recubierta (10-60 min, RT) Mezclar objetivo (mAb de ratón DYKDDDDK, n.º E8004) + biblioteca Ph.D. (20 min RT). Capturar complejos fago-diana con perlas magnéticas de proteína G (n.º S1430) Lavar 10 x 1 ml TBST, pipetear o volcar 10 x 1 ml TBST, sedimentar con imán Elución 1 ml de biotina 0,1 mM (n.º N7024) (30 min RT) 1 ml de tampón de glicina pH 2 (10-20 min RT), neutralizar a pH 9 con TrisHCl Enriquecer en cultivo de E. coli (4-5 h) Repetir la selección 1-2 veces más Estudios de secuenciación y/o unión (cebador de secuenciación -96 gIII, n.º S1259) P: ¿Cuál de las tres bibliotecas preparadas debería elegir? R: Las tres bibliotecas preconfiguradas (Ph.D.-7, Ph.D-12 y Ph.D-C7C) pueden contener ligantes para una diana determinada. La elección de la biblioteca no depende del tipo de diana ni de la aplicación posterior. Por este motivo, recomendamos que la mayoría de los clientes comiencen con cualquiera de las dos bibliotecas lineales, Ph.D-7 o Ph.D-12. La excepción es cuando se requiere una estructura en bucle para la aplicación, en cuyo caso se recomienda la biblioteca Ph.D.-C7C con bucle disulfuro. P: ¿Cuál es la diferencia entre las tres bibliotecas preconfiguradas? R: Las bibliotecas lineales Ph.D-7 y Ph.D-12 tendrán ligantes para la mayoría de las dianas. Para aquellas dianas que no funcionan con las bibliotecas lineales, la biblioteca Ph.D-C7C con bucle disulfuro puede tener ligantes para la diana de interés. La biblioteca Ph.D.-7 consta de péptidos lineales de 7 mer aleatorizados y puede ser más útil para dianas que requieren elementos de unión concentrados en un tramo corto de aminoácidos. La biblioteca Ph.D.-12 consta de péptidos lineales aleatorizados de 12 mer. Estos péptidos de 12 mer tienen una diversidad equivalente a la biblioteca Ph.D.-7, pero se extienden sobre un espacio de secuencia más amplio. Una biblioteca estructuralmente restringida, como la biblioteca Ph.D.-C7C, es especialmente útil para dianas cuyos ligandos nativos se encuentran en el contexto de un bucle de superficie, como anticuerpos con epítopos estructurales. Además, imponer restricciones estructurales al ligando no unido puede resultar en una entropía de unión menos desfavorable, mejorando la energía libre total de unión en comparación con los ligandos no restringidos (O'Neil, KT et al., 1992, Proteins 14, 509-515). Una desventaja importante de las bibliotecas estructuralmente restringidas es que la restricción puede "congelar" una conformación requerida para la unión a la diana, impidiendo la unión por completo en lugar de mejorar la afinidad (McConnell, SJ et al., 1994, Gene 151, 115-118). Independientemente de la biblioteca, normalmente solo de 3 a 5 posiciones son críticas para la unión con una diana. P: ¿Se puede usar una cepa bacteriana diferente con el Phage Display de Ph.D.™? R: En teoría, otras cepas F+ que contienen la mutación supresora supE (como XL1-Blue y DH5αF´) deberían funcionar con nuestro sistema de visualización de fagos. Sin embargo, no hemos probado estas cepas con nuestras bibliotecas y desconocemos si se producirán efectos sutiles en la expresión o el transporte de ciertos péptidos fuera de la célula. Dado que las bibliotecas de Ph.D. se crean en ER2738 (NEB n.° E4104S), sabemos que todos los péptidos de las bibliotecas se pueden expresar correctamente en esta cepa. Por lo tanto, recomendamos esta cepa sobre cualquier otra. P: No se observan placas al titular con una biblioteca de visualización de fagos de Ph.D.™. R: A diferencia de lambda, M13 es un fago no lítico y no produce placas claras. Las placas M13 son áreas de crecimiento celular disminuido, no de lisis, y por lo tanto pueden ser difíciles de ver. Intente sostener la placa a contraluz. Además, dado que el vector utilizado para preparar la biblioteca porta el gen lacZα, las placas serán azules y más fáciles de ver al usar una cepa alfa complementaria, como la E. coli K12 ER2738 suministrada, y sembrar en placas Xgal/IPTG. Asegúrese también de que el rango de dilución sea adecuado para el fago que está titulando. Para fagos amplificados, sembrar 10 µL de diluciones 1:10⁻¹ - 1:10⁻¹; para eluidos de cribado no amplificados, probar diluciones 1:10⁻¹ - 1:10⁻¹ para las primeras rondas, y 1:10⁻¹ - 1:10⁻¹ para las rondas posteriores. Si el fago no está suficientemente diluido, las placas confluirán en la placa y parecerá que no hay placas (o que se observará un tinte azulado al usar placas Xgal). En ocasiones, tras la precipitación con PEG, el fago se aglutina y no se diluye correctamente. Como resultado, podría tener una placa con demasiadas placas fusionadas. Asegúrese de dar al fago suficiente tiempo para resuspenderse después de la precipitación (> 1 hora) y agite bien cada tubo de dilución (~10 segundos). P: Estoy usando Phage Display Ph.D.™ y el título del fago amplificado es bajo. R: Para que el fago M13 se amplifique eficazmente, es fundamental que los cultivos estén bien aireados y que se infecten en las primeras etapas de su crecimiento. Recomendamos la amplificación en cultivos de 20 mL en matraces Erlenmeyer de 250 mL, en un agitador a 250 rpm. La amplificación en recipientes más pequeños, como tubos cónicos de 50 mL, dará como resultado rendimientos mucho menores de fago amplificado. El fago M13 debe añadirse a un cultivo logarítmico temprano, A600 < 0,01, o a una dilución 1:100 de un cultivo de la noche anterior. El rendimiento del fago amplificado alcanza su máximo después de 4,5-5 horas a 37 °C; una incubación más prolongada puede provocar deleciones y no se recomienda. Si se realiza una elución inespecífica con tampón de glicina a pH 2,2, el fago eluido debe neutralizarse como se describe en el manual antes de la amplificación. P: Estoy utilizando Phage Display de Ph.D.™ y las plantillas de ADN del fago no producen una secuencia legible. R: El protocolo de Purificación Rápida de Plantillas de ADN Monocatenario para Reacciones de Secuenciación debería proporcionar una plantilla monocatenaria con la pureza suficiente para las reacciones de secuenciación. El procedimiento debe seguirse exactamente como se describe en el manual: la precipitación prolongada con etanol, la precipitación a 20 °C o la centrifugación durante más de 10 minutos darán como resultado la coprecipitación de la sal y las proteínas del fago, lo que inhibirá la secuenciación. Además, es crucial que el pellet del fago esté completamente suspendido en el tampón de yoduro antes de agregar etanol. Si los problemas persisten, o si se utiliza otro método de secuenciación, se puede agregar un paso de extracción con fenol:cloroformo: después de la suspensión en tampón de yoduro, agregue 2 volúmenes de TE, extraiga una vez con fenol:cloroformo (1:1) y una vez con cloroformo, y precipite con etanol. 5 µL de plantilla suspendida (aproximadamente 0,5 µg) deberían ser suficientes para la secuenciación; la cuantificación debe confirmarse mediante electroforesis en gel de agarosa utilizando 0,5 µg de ADN M13 monocatenario (NEB n.º N4040S) como estándar. P: Estoy usando Ph.D.™ Phage Display y las plantillas de secuenciación no se ejecutan correctamente en un gel. R: Las plantillas de secuenciación preparadas con el método del manual son monocatenarias (aprox. 7250 nucleótidos) y, por lo tanto, no se alinean con marcadores bicatenarios de la misma longitud. El tamaño aparente variará según el voltaje aplicado, la concentración de etidio y agarosa en el gel, y si se utiliza TBE o TAE como tampón de ejecución. Recomendamos encarecidamente usar ADN M13 monocatenario (p. ej., M13mp18 monocatenario, NEB n.° N4040) como marcador. P: Estoy usando Ph.D.™ Phage Display y, tras 4 o más rondas de cribado, todos los clones son fagos de tipo silvestre (placas blancas). R: En una ronda típica de biopanning, se hacen reaccionar aproximadamente 2 x 10¹¹ fagos de entrada con el fago diana, y se eluyen entre 10³ y 10¹¹ fagos totales tras el lavado. Esto corresponde a un enriquecimiento de 10¹¹ a 10¹¹ veces por ronda. Dado que la biblioteca contiene aproximadamente 2 x 10¹¹ clones diferentes, el grupo de fagos eluidos debería, en teoría, estar completamente enriquecido en favor de las secuencias de unión después de solo 2 o 3 rondas. Una vez alcanzado este punto, las rondas posteriores de amplificación y panning solo resultarán en la selección de fagos con una ventaja de crecimiento sobre el fago de la biblioteca. Por ejemplo, niveles extremadamente bajos de fagos silvestres contaminantes ambientales (menos de una parte por mil millones) superarán por completo al grupo si se realizan demasiadas rondas de amplificación, independientemente de la intensidad de la selección in vitro. P: Al realizar un experimento con Ph.D.™ Phage Display, el ELISA indica que la unión del fondo a la placa es tan alta como la unión a la diana. R: Si se realiza un cribado contra una placa de poliestireno recubierta con la diana (Cribado en Fase Superficial o Recubrimiento Directo de la Diana), es posible seleccionar inadvertidamente péptidos que se unen específicamente a la superficie de poliestireno (véase Adey, NB et al. (1995) Gene 156, 27-31). Estos péptidos producirán señales de ELISA idénticas en presencia y ausencia de la diana, ya que la placa de ELISA también está hecha de poliestireno. Estos "ligantes plásticos" suelen ser ricos en residuos aromáticos (Phe, Tyr, Trp, His), que a menudo se alternan (la secuencia FHWTWYW es un ligante plástico descubierto y caracterizado en NEB). La selección de ligantes plásticos suele ocurrir cuando no hay una fuerte preferencia por la diana en las secuencias peptídicas presentes en la biblioteca: otras bibliotecas pueden producir las secuencias específicas de la diana deseada. La selección de péptidos específicos de poliestireno se puede evitar utilizando el método de selección en fase de solución, siempre que sea posible, para una diana determinada. El fago reacciona con la diana en solución y los complejos fago-diana se capturan en microesferas que se unen específicamente a la diana. P: Al utilizar Phage Display Ph.D.™, la selección arrojó una secuencia consenso, pero no una señal ELISA. R: Al caracterizar clones de fagos mediante el protocolo ELISA del manual, es difícil añadir más de 10¹2 viriones por pocillo de 100 µL. Esto corresponde a una concentración de fago de tan solo 16 nM. A esta concentración, solo se puede observar una señal ELISA inequívocamente positiva si la afinidad de unión es micromolar o superior. La naturaleza iterativa de la selección de fagos permite la identificación de ligandos con un amplio rango de afinidades, desde subnanomolares hasta 1 milimolar, por lo que los ligandos con menor afinidad no mostrarán una señal ELISA positiva. En este caso, es necesario aumentar la concentración del ligando seleccionado, ya sea sintetizando un péptido correspondiente a la secuencia seleccionada (asegúrese de incluir la secuencia espaciadora GGGS en el extremo C y amidar el carboxilato C-terminal si es posible), o expresando la secuencia seleccionada como una fusión N-terminal a una proteína más pequeña. Alternativamente, se puede realizar un ELISA sándwich en el que se inmoviliza el fago seleccionado y se aplica un exceso de diana en la fase líquida. Este procedimiento requiere un anticuerpo contra la proteína diana o algún otro medio para detectar la proteína diana unida. Recubra los pocillos durante la noche con anticuerpo anti-M13 (sin HRP), lave y agregue diluciones seriadas de cada clon de fago (un clon por fila). Después de 1 hora, lave el fago no unido y agregue un exceso de proteína diana (0,1 - 1 µM) en TBST. Incube de 1 a 2 horas a temperatura ambiente, lave la diana no unida y detecte la diana unida con un anticuerpo ligado a enzima. P: ¿Dónde puedo encontrar referencias para bibliotecas de visualización de fagos Ph.D.™? R: Constantemente se publican nuevas publicaciones. Busque en la literatura con "visualización de fagos de péptidos", con o sin la aplicación que prefiera, y encontrará referencias para nuestras bibliotecas. Además, consulte las referencias para aplicaciones específicas, así como los enlaces a publicaciones fundamentales, aquí. Asimismo, contamos con una base de datos con función de búsqueda de referencias más recientes, accesible desde la esquina inferior derecha de nuestra página principal a través de Publicaciones. P: ¿Cuál es la secuencia pIII de un clon sin inserto? ¿Qué hay en el extremo N-terminal de un clon PhD? R: El marco de lectura abierto para la secuencia gIII nativa comienza con 5'-GTG AAA AAA TTA… (véase el inicio de GTG en la revisión Kozak, M. (1999) Gene 234, 187-208 Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes; van Wezenbeek, PMGF et al (1980) Gene 129-148). El extremo N-terminal de pIII incluye una secuencia líder necesaria para procesar la proteína recién traducida en la célula. El péptido maduro, tal como se muestra en el fago M13, se ha escindido en el sitio de la peptidasa líder. Cabe destacar que la región aleatoria estará en el mismo marco de lectura que la secuencia líder. Traducción de gIII para M13KE o un clon sin inserción: MKKLLFAIPLVVPFYSHS // AETVES Traducción de gIII para un clon PhD (X es una posición aleatoria): Clon Ph.D.-12 n.º E8210S, E8111L MKKLLFAIPLVVPFYSHS // X12-GGGS-AETVES…pIII→ Clon Ph.D.-7 n.º E8211S MKKLLFAIPLVVPFYSHS // X7-GGGS-AETVES… pIII→ Clon Ph.D.-C7C n.º E8212S MKKLLFAIPLVVPFYSHS // ACX7C-GGGS-AETVES…pIII→ Una nota adicional: un clon Ph.D. tendrá 5 copias de la misma proteína pIII, es decir, (Ph.D.-7) X7-GGGS-AETVES…, en un extremo de la partícula cilíndrica. // indica el sitio de escisión de la peptidasa líder P: ¿Cómo se clonan las bibliotecas de visualización de fagos PhD? R: La figura a continuación muestra el esquema de clonación. Consulte nuestro manual del sistema de clonación PhD NEB #E8101S para obtener más detalles. Véase también Noren, CJ y Nore, KA 2001 Métodos 23, 169-178. doi:10.1006/meth.2000.1118 P: ¿Dónde puedo encontrar la secuencia completa del genoma del vector parental, M13KE, utilizado para clonar las bibliotecas de visualización de péptidos Ph.D.? R: La página de la herramienta Secuencias y mapas de ADN tiene la secuencia de nucleótidos en varios formatos, así como un mapa de M13KE. Tenga en cuenta que NEB #E8101S contiene ADN M13KE de doble cadena, también conocido como forma replicativa (RF) (20 ug).