New England Biolabs, E9642S, módulo de cebadores NEBNext® RSV

Categorías relacionadas con NEBNext Secuenciación del virus respiratorio sincitial (VRS), Enfermedades infecciosas y aplicaciones de secuenciación ARTIC Polimerasas para la preparación de bibliotecas NGS Preguntas frecuentes P: ¿Qué reactivos adicionales se necesitan para la síntesis y amplificación de ADNc con el módulo de cebadores NEBNext RSV (NEB n.º E9642)? R: NEB recomienda combinar el módulo de cebadores NEBNext RSV con el kit LunaScript® Multiplex One-Step RT-PCR (NEB n.º E1555). Puede encontrar un protocolo para el uso de estos reactivos para la generación de amplicones de VRS aquí. P: ¿Están disponibles las secuencias de cebadores NEBNext RSV (NEB n.º E9642)? R: Sí, las secuencias de cebadores NEBNext RSV se pueden encontrar aquí: https://github.com/nebiolabs/rsvab-sequencing. P: ¿Qué cepas de VRS pueden ser diana con los cebadores NEBNext RSV (NEB n.º E9642)? R: Las mezclas de cebadores NEBNext RSV contenidas en el módulo de cebadores NEBNext RSV se dirigen tanto a las cepas RSV A como a las RSV B, uniéndose a regiones que se conservan en las cepas RSV A y RSV B, así como a regiones específicas del RSV A o del RSV B. P: ¿Es posible dirigirse solo al RSV A o al RSV B con las mezclas de cebadores incluidas en el módulo de cebadores NEBNext RSV (NEB n.º E9642)? R: No, ambas mezclas de cebadores incluidas en el módulo de cebadores NEBNext RSV contienen algunos pares de cebadores que se dirigen tanto al RSV A como al RSV B. P: ¿Qué reactivos y protocolos de preparación de bibliotecas se pueden utilizar para secuenciar amplicones creados con el módulo de cebadores NEBNext RSV (NEB n.º E9642)? R: Los amplicones producidos con el módulo de cebadores NEBNext RSV son independientes de la plataforma de secuenciación. Sin embargo, dado que los amplicones varían de 400 pb a 1400 pb de longitud, la fragmentación del ADNc puede ser necesaria para enfoques de secuenciación de lectura corta. Para la secuenciación en plataformas Illumina, NEB recomienda emparejar el módulo de cebadores NEBNext RSV con el kit de preparación de biblioteca de ADN NEBNext UltraExpress® FS (NEB #E3340). Un protocolo (Sección 2) para el uso de estos reactivos para la secuenciación de amplicones de RSV se puede encontrar aquí. El protocolo (Sección 3, página 11) y los reactivos necesarios para secuenciar amplicones NEBNext RSV en las plataformas de Oxford Nanopore Technologies, también se pueden encontrar aquí. P: ¿Hay un rango de valor de Ct recomendado para las entradas de RSV? R: NEB recomienda entradas de al menos 1000 copias del genoma. Como los valores de Ct varían según el tipo de ensayo y el genoma diana del ensayo, no tenemos un rango de valor de Ct específico. Sin embargo, como se muestra en la figura a continuación, la secuenciación de muestras clínicas con el ensayo BioFire®, con valores Ct < 30, muestra una alta cobertura del genoma. Consulte la Figura 8 en la página del producto para ver los datos generados a partir de muestras clínicas. P: ¿Cuál es la profundidad de lectura mínima necesaria cuando se utiliza el módulo de cebadores NEBNext RSV (NEB n.º E9642)? R: NEB recomienda una profundidad de lectura mínima de 0,5 M lecturas de PE por biblioteca para la secuenciación de Illumina. Para la secuenciación de ONT en una celda de flujo MinION, NEB recomienda una profundidad de lectura mínima de 50 000 lecturas por biblioteca. P: ¿Qué tipos de muestras se admiten cuando se utiliza el módulo de cebadores NEBNext RSV (NEB n.º E9642)? R: Los protocolos proporcionados se han validado con plantillas de ARNg disponibles comercialmente de alta calidad. Otros tipos de muestras que se han probado incluyen aislados de ARN de cultivos celulares y ARN extraído de muestras clínicas (p. ej., hisopos nasofaríngeos) (datos que se muestran en la Figura 8 en la página del producto). P: ¿Qué métodos de extracción se pueden utilizar para aislar el ARNg del VRS antes de la RT-PCR? R: Se puede utilizar el ARN aislado con el kit de extracción de ADN/ARN viral Monarch® Mag de NEB (NEB n.° T4010S) y el kit Monarch Total RNA Miniprep (NEB n.° T2010). También se pueden utilizar otros métodos de extracción de ARN basados ​​en microesferas y columnas. P: ¿Existen recomendaciones para la purificación de los amplicones del VRS antes de la preparación de la biblioteca cuando se utiliza el módulo de cebadores NEBNext RSV (NEB n.° E9642)? R: Los protocolos de preparación de bibliotecas adjuntos para la secuenciación de amplicones NEBNext RSV utilizan amplicones del VRS diluidos como insumos para la preparación de la biblioteca. Sin embargo, si se prefiere la purificación del ADNc del amplicón, se recomienda una purificación 0,8X con microesferas SPRIselect o AMPure. Por ejemplo, si el volumen de ADNc del amplicón es de 25 µl, se utilizarían 20 µl (0,8X) de microesferas SPRIselect/AMPure para unir el ADNc, seguido de dos lavados con 200 µl de EtOH al 80 % y una elución en 15-30 µl de agua. P: ¿Se recomienda introducir amplicones de ADNc del VRS (después de usar el módulo de cebadores NEBNext RSV (NEB n.° E9642)) en las reacciones de preparación final de Oxford Nanopore Technologies para la preparación de bibliotecas de baja o alta plexitud? R: NEB recomienda utilizar un mínimo de 6 códigos de barras nativos de ONT por secuenciación. Para secuenciaciones que utilizan de 6 a 12 códigos de barras, recomendamos introducir 350 ng de amplicones con un tamaño de 400-1400 pb por muestra en la reacción de preparación final para la preparación de la biblioteca de ONT. Si se utilizan más de 48 códigos de barras, se pueden usar de 20 ng a 40 ng de amplicones con un tamaño de 400-1400 pb por muestra como entrada para la reacción de preparación final de la biblioteca ONT. P: ¿Puedo minimizar la ligadura inespecífica de códigos de barras entre muestras agrupadas después de usar el módulo de cebadores NEBNext RSV (NEB n.° E9642)? R: Sí, añada 2 µl de proteinasa K termolábil (NEB n.° P8111S) a cada muestra tras la reacción de ligadura de códigos de barras de ONT e incube a 37 °C durante 15 minutos. Tras el tratamiento con proteinasa K termolábil, añada 2 µl de EDTA (incluido en el kit/los kit/s de codificación de barras nativa V14 de Oxford Nanopore Technologies) a cada muestra con código de barras y proceda con la agrupación y la limpieza del conjunto de muestras con código de barras.