New England Biolabs, G8024S, nucleasa activa de sal NEBExpress®, grado GMP

Categorías relacionadas Herramientas para proteínas,, Enzimas modificadoras de ADN y tecnologías de clonación Aplicaciones Purificación de proteínas,, Herramientas de análisis de proteínas,, Especificación de expresión de proteínas Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 32 pmol de FAM del oligonucleótido de horquilla marcado con FAM-BHQ1 en 1 minuto a 25 °C en una reacción de 50 µL en 25 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,005% Tween 20 (pH 8,5 a 25 °C). Tampón de almacenamiento Tris-HCl 25 mM NaCl 500 mM MgCl2 5 mM Glicerol al 50% pH 7,5 a 25 °C Preguntas frecuentes P: Veo que NEB ofrece dos versiones de NEBExpress® Salt Active Nuclease. ¿Cuál es la diferencia entre la nucleasa activa salina NEBExpress (NEB #M0764) y la nucleasa activa salina NEBExpress, grado GMP (NEB #G8024)? R: La nucleasa activa salina NEBExpress, grado GMP se fabrica según los estándares de calidad GMP* de New England Biolab para garantizar una documentación de calidad rigurosa y cumplir con las necesidades de fabricación, e incluye pruebas adicionales como la de endotoxinas y carga microbiana. Ambas enzimas son enzimáticamente idénticas y están formuladas en el mismo tampón. Sin embargo, la nucleasa activa salina NEBExpress, grado GMP (NEB #G8024) se ofrece a una concentración diez veces mayor, 1 000 000 U/ml (1 mg/ml), para minimizar la dilución del cultivo celular/muestra, en comparación con la nucleasa activa salina NEBExpress (NEB #M0764), que se ofrece a 100 000 U/ml. P: ¿Puedo solicitar la nucleasa activa salina NEBExpress®, grado GMP (NEB n.° G8024) en un volumen mayor o con una concentración diferente? R: Sí. Para solicitar la nucleasa activa salina NEBExpress®, grado GMP (NEB n.° G8024) en un tamaño mayor o en un formato personalizado, contacte con nuestro equipo de Soluciones Personalizadas. P: ¿Cuáles son las ventajas de trabajar con un tampón con alto contenido de sal? R: Realizar un proceso de purificación con alto contenido de sal (≥ 200 mM NaCl) permite que las impurezas (ácidos nucleicos) se desprendan de las proteínas o los virus al interrumpir las interacciones electrostáticas entre estas moléculas. Un alto contenido de sal también puede mejorar la solubilidad de las proteínas cuando la agregación se debe a interacciones electrostáticas. Por estas razones, muchos métodos de bioprocesamiento requieren un alto contenido de sal. La nucleasa activa salina NEBExpress® se puede utilizar directamente en estas condiciones para mitigar aún más los problemas de alta viscosidad, reducir la contrapresión o eliminar el ácido nucleico. P: ¿Tiene la nucleasa activa salina NEBExpress® la misma eficiencia que la nucleasa de Serratia marcescens? R: No. La nucleasa activa salina NEBExpress es más activa (aproximadamente 4 veces, normalizada a la misma concentración) que la nucleasa de Serratia marcescens en ADN y ARN cuando se utiliza en un tampón con NaCl/KCl ≥ 300 mM. P: ¿Cómo se compara la definición de unidad de la nucleasa activa salina NEBExpress® con la de otras nucleasas activas salinas similares? R: Aunque las condiciones del ensayo de definición de unidad de la nucleasa activa salina NEBExpress difieren (temperatura, sustrato y tampón) de las de otras nucleasas similares del mercado, estimamos que la nucleasa activa salina NEBExpress es hasta dos veces más activa que otras nucleasas salinas. Para cambiar de otra nucleasa salina a la nucleasa activa salina NEBExpress, recomendamos probar una sustitución 1:1 basada en las unidades. P: ¿Puedo usar la nucleasa activa salina NEBExpress® en un tampón con bajo contenido de sal? R: Sí. La nucleasa activa salina NEBExpress conserva el 60 % de su actividad con 250 mM de NaCl o KCl y el 15 % sin sal. Dependiendo de la aplicación (reducción de la viscosidad, degradación parcial o total de ácidos nucleicos), puede ser necesario aumentar la concentración de la enzima y el tiempo de incubación con bajo contenido de sal. P: ¿Es la nucleasa activa salina NEBExpress® compatible con columnas de afinidad como IMAC? R: La nucleasa activa salina NEBExpress no está marcada y puede usarse para purificar proteínas marcadas, como una proteína marcada con His mediante IMAC. P: ¿Puedo eliminar la nucleasa activa salina NEBExpress® de mi muestra? R: Sí. La nucleasa activa salina NEBExpress se une firmemente a una columna de intercambio catiónico debido a su alto pI y, por lo tanto, puede eliminarse fácilmente mediante captura en una resina de intercambio catiónico (se recomiendan las resinas Source 30S, SP HP y POROS 50HS). P: Después de su uso, ¿cómo puedo inactivar la nucleasa salina activa NEBExpress®? R: La nucleasa salina activa NEBExpress® se puede inactivar mediante uno de los siguientes métodos: Inactivación térmica: Incubar a 65 °C durante 2 h, a 80 °C durante 1 h o a 95 °C durante 20 min. Inactivación química: Añadir > 10 mM de EDTA, o SDS al 0,5 % o > 20 mM de TCEP. Inactivación química y térmica: Añadir 1 mM de DTT e incubar a 55 °C durante 30 min. Degradación enzimática: Añadir proteinasa K (NEB n.° P8107S) o proteinasa K termolábil (NEB n.° P8111S). P: ¿En qué se diferencian la nucleasa salina activa NEBExpress® y la DNasa I-XT (NEB n.° M0570)? R: La nucleasa activa salina NEBExpress degrada ADN y ARN, mientras que la DNasa I-XT solo degrada ADN. Es activa entre 0 y 1000 mM de concentración de sal (óptima a 500 mM), mientras que la DNasa-I XT ha sido diseñada para ser activa entre 0 y 300 mM de sal. Además, la nucleasa activa salina NEBExpress se puede eliminar fácilmente en una sola columna, ya que se une muy eficientemente a la resina de intercambio catiónico. P: ¿Cuál es el peso molecular de la nucleasa activa salina NEBExpress®? R: La nucleasa activa salina NEBExpress tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kDa. P: ¿Está glicosilada la nucleasa activa salina NEBExpress®? R: No. La nucleasa activa salina NEBExpress se produce a partir de E. coli y, por lo tanto, no está glicosilada, presentándose como una sola banda de aproximadamente 25 kDa en un gel de proteínas.