New England Biolabs, L4001P, LyoPrime Luna® Probe One-Step RT-qPCR Mix con UDG

Suministrado como una torta liofilizada, el LyoPrime Luna Categorías relacionadas Luna® qPCR y RT-qPCR Aplicaciones qPCR y RT-qPCR basadas en sondas, qPCR y RT-qPCR, RT-qPCR de dos pasos, Preguntas frecuentes P: ¿Cómo se debe almacenar la mezcla LyoPrime Luna? R: Formato del vial: Antes de su uso, los productos LyoPrime Luna se pueden almacenar a temperatura ambiente (15 a 25 °C) y proteger de la luz (por ejemplo, en la caja original del producto u otra caja cerrada). El vial de vidrio, la tapa y el tapón de goma son impermeables a la humedad, lo que permite el almacenamiento sin desecante. El almacenamiento a -20 °C no es necesario ni se recomienda antes de la rehidratación. Puede encontrar información adicional sobre almacenamiento y rehidratación aquí. Formato de la placa: Antes de su uso, la mezcla LyoPrime Luna se debe almacenar a temperatura ambiente (15 °C a 25 °C) sin abrir en su bolsa de aluminio original. La bolsa de aluminio y el desecante en su interior protegen el reactivo liofilizado de la humedad atmosférica y la luz. Los tubos de tiras no utilizados deben volver a colocarse inmediatamente en la bolsa de aluminio con el desecante, sellando bien el cierre hermético y almacenándolos a temperatura ambiente. Puede encontrar información adicional sobre almacenamiento y rehidratación aquí. P: ¿Cómo rehidrato la mezcla LyoPrime Luna? ¿Se puede resuspender a una concentración mayor? R: Formato del vial: Para rehidratar la mezcla liofilizada como una mezcla maestra 2X, retire la tapa y el tapón del vial, añada 675 μl de agua libre de nucleasas y mezcle brevemente mediante pipeteo o agitación suave en vórtex. La mezcla liofilizada puede rehidratarse hasta 4 veces para dar cabida a volúmenes de muestra mayores. Puede encontrar una demostración en vídeo aquí. Consulte también la página del protocolo para obtener más información. Formato de la placa: La mezcla liofilizada de cada pocillo puede rehidratarse directamente con cebadores, sondas y plantilla para lograr una mezcla maestra 1X (volumen de reacción de 20 μl). Por lo tanto, se recomienda encarecidamente preparar una mezcla de ensayo que incluya cebador y sonda(s) y que se dispense en cada pocillo. Tras añadir la mezcla de ensayo, mezcle brevemente pipeteando o agitando con un agitador de microplacas y, a continuación, añada la plantilla. Puede encontrar información sobre la rehidratación en la página del protocolo (aquí) y también se muestra en este vídeo. P: ¿Son las mismas condiciones de reacción para las mezclas liofilizadas y líquidas de Luna? R: Sí, las condiciones de reacción para la mezcla LyoPrime Luna® Probe One-Step RT-qPCR con UDG (NEB n.° L4001) son las mismas que para nuestro producto líquido correspondiente, la mezcla Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X con UDG (NEB n.° M3019). Ambas mezclas incluyen la transcriptasa inversa Luna WarmStart, diseñada específicamente para este ensayo, que posee mayor termoestabilidad que muchas otras RT y tiene una temperatura de reacción óptima de 55 °C. Consulte la página del protocolo (vial L4001 o placa L4001) para obtener más información sobre la configuración de la reacción y las condiciones de ciclado. P: Al disolver la sonda LyoPrime Luna® liofilizada, la solución al principio se ve turbia. ¿Es normal? R: Sí, es normal. La pastilla liofilizada en formato vial se disuelve inmediatamente, pero la liberación de aire provoca un aumento temporal de la turbidez. El aire se desgasificará de forma natural en unos 20 segundos o tras una agitación suave en vórtex. En el formato de placa de 96 pocillos, la agitación suave en vórtex disuelve inmediatamente la pastilla. P: ¿Puedo preparar mi Luna® RT-qPCR a temperatura ambiente? R: Sí. La Luna RT-qPCR se puede preparar a temperatura ambiente, pero para obtener mejores resultados, las reacciones deben mantenerse en hielo antes del termociclado. Ambas enzimas presentes en el kit, la ADN polimerasa Taq Hot Start y la transcriptasa inversa Luna WarmStart®, están controladas por inhibidores reversibles sensibles a la temperatura (SOMAmer®). Estos SOMAmers inhiben la actividad de la polimerasa por debajo de 45 °C, lo que previene la actividad inespecífica no deseada hasta que la reacción se calienta por encima de la temperatura de liberación durante el paso de transcripción inversa. P: ¿Por qué la mezcla Luna® qPCR es azul? ¿Este colorante interferirá con la detección? R: La mezcla Luna qPCR contiene un colorante de referencia visual inerte que le da un color azul claro. Este color facilita la identificación de los pocillos de una placa de qPCR que se han cargado con reactivos, lo cual puede ser difícil debido al pequeño tamaño de los pocillos y la opacidad de muchas placas de qPCR de 96 y 384 pocillos. El colorante azul se ha evaluado ampliamente en PCR y qPCR y no inhibe ni interfiere con la detección de qPCR. P: ¿Puedo ejecutar la mezcla Luna® qPCR en mi instrumento de qPCR? R: Las siguientes mezclas Luna qPCR contienen un colorante de referencia pasivo universal que permite la compatibilidad con una amplia variedad de instrumentos en tiempo real, incluidos aquellos que no utilizan un colorante de normalización de referencia pasivo (por ejemplo, Bio-Rad® CFX), una referencia pasiva de baja concentración (por ejemplo, Applied Biosystems® 7500 o QuantStudio®) o una referencia pasiva de alta concentración (por ejemplo, Applied Biosystems 7900 o StepOne®). Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004) Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3005) Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3006) Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG (NEB #M3019) LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix con UDG (NEB #L4001) El Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (sin ROX) (NEB #E3007) y Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG (sin ROX) (NEB #M3029) carecen de un colorante de referencia y se pueden usar con cualquier instrumento que no requiera normalización ROX. Consulte las instrucciones del fabricante del instrumento para obtener más detalles. Además, Luna Mix puede usarse en condiciones de ciclo estándar o rápido. P: ¿Necesito añadir ROX? R: Algunos instrumentos en tiempo real recomiendan el uso de un colorante de referencia pasivo (normalmente ROX) para compensar las variaciones entre pocillos que podrían deberse a limitaciones de la máquina, como el "efecto de borde", burbujas, pequeñas diferencias de volumen y autofluorescencia del polvo o partículas en la reacción. Sin embargo, la normalización con ROX apenas reduce las variaciones causadas por errores de pipeteo de plantillas/cebadores, mezcla heterogénea y problemas de evaporación/condensación. Los siguientes productos Luna® qPCR contienen un colorante de referencia pasivo universal que permite la compatibilidad con diversos instrumentos en tiempo real, incluidos aquellos que no utilizan normalización de referencia pasiva y aquellos que utilizan una cantidad baja o alta de colorante de referencia pasivo (ROX). Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004) Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3005) Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3006) Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG (NEB #M3019) LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix con UDG (NEB #L4001) El Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (sin ROX) (NEB #E3007) y Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG (sin ROX) (NEB #M3029) carecen de un colorante de referencia y se pueden usar con cualquier instrumento que no requiera normalización ROX. Consulte las instrucciones del fabricante del instrumento para obtener más detalles. Instrumento qPCR ROX Bio-Rad® iQ™5, CFX96, CFX384, Opticon Roche Lightcycler® Qiagen Rotor-Gene™ Eppendorf Mastercycler® Cepheid® SmartCycler® No recomendado/obligatorio Applied Biosystems® 7500, 7500 Fast, QuantStudio™, ViiA7™ Agilent Mx™ Low ROX (~50 nM final) Applied Biosystems® 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast, StepOne™, StepOnePlus™ High ROX (~500 nM final) P: ¿Qué muestras de ARN se pueden usar en RT-qPCR con Luna® Mix? R: Para obtener los mejores resultados, recomendamos una extracción o purificación del material de partida de ARN. El kit Luna RT-qPCR funciona con ácidos nucleicos de una variedad de tipos de muestras purificadas mediante métodos típicos basados ​​en columnas (p. ej., el kit Monarch® RNA Miniprep (NEB n.º T2010)). Al realizar estudios con cultivos de células de mamíferos, los lisados ​​celulares generados por el módulo de lisis Luna Cell Ready (NEB n.º E3032) se pueden agregar a todos los reactivos Luna One-Step RT-qPCR. Además, numerosos estudios han demostrado directamente la compatibilidad de los reactivos Luna con saliva y otras muestras clínicamente relevantes mediante protocolos de preparación de muestras crudas. SalivaDirect es un ejemplo. P: ¿Cuánta plantilla de ARN debo usar en mi reacción de RT-qPCR? R: El kit Luna® Universal One-Step RT-qPCR funciona bien con plantillas de ARN purificadas, incluidas muestras de ARN total, ARNm y transcripciones in vitro. Cantidad en reacción de 20 μl ARN total ≤ 1 μg poli(A)-ARN ≤ 0,1 μg transcripciones in vitro ≤ 10⌃9 copias P: ¿Puedo ejecutar reacciones multiplex con los kits Luna® Probe One-Step RT-qPCR? ¿Necesito cambiar mis condiciones de reacción? R: Sí, se han ejecutado con éxito reacciones multiplex que amplifican hasta 5 dianas utilizando los kits Luna Universal Probe RT-qPCR. Seleccione los diferentes fluoróforos correspondientes a canales de detección separados del instrumento en tiempo real. Cada diana debe probarse primero en una reacción singleplex. Para cada amplicón, comience incluyendo 400 nM de cebador directo e inverso y 200 nM de sonda en cada reacción. Si se observa que el rendimiento de un amplicón en particular se deteriora cuando se utiliza en un ensayo multiplex en comparación con sus resultados singleplex, las reacciones pueden requerir optimización. Puede ser útil reducir las concentraciones de cebador para un objetivo abundante o de alto número de copias y/o aumentar las concentraciones de cebador para los objetivos de baja abundancia o bajo número de copias. Es posible que se necesite una mayor optimización a medida que aumenta la multiplexidad, utilizando los siguientes parámetros como directrices: cebador 100–900 nM, sonda 100–500 nM. Ejemplo de una reacción 3-plex utilizando el kit de sonda Luna Universal One-Step RT-qPCR en un instrumento Applied Biosystems™ 7500 Fast: P: ¿Puedo utilizar una sonda marcada con ROX con las mezclas de sondas Luna® que contienen un colorante de referencia ROX universal? R: Sí. Sin embargo, se deben considerar los requisitos de normalización de referencia pasiva del instrumento en tiempo real. Para los instrumentos en los que no se utiliza normalización ROX, generalmente se puede utilizar una sonda ROX sin preocupaciones ni modificaciones del instrumento. Para los instrumentos en los que se utiliza ROX para la normalización, normalmente no se recomiendan las sondas ROX y esta opción no está disponible en las configuraciones típicas del instrumento. Aún es posible usar sondas ROX siempre que la normalización ROX esté desactivada, pero se perderán sus beneficios. Si prefiere una mezcla sin ROX, consulte el kit Luna Probe One-Step RT-qPCR (sin ROX) (NEB n.° E3007) o la mezcla Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X con UDG (sin ROX) (NEB n.° M3029), o escriba a info@neb.com. P: Otras empresas recomiendan una incubación de 2 minutos a 25 °C para prevenir la contaminación cruzada. ¿Es suficiente una incubación de 30 segundos a 25 °C? R: Sí, dada la robusta actividad del UDG termolábil de NEB, observamos la degradación de hasta aproximadamente 100 000 copias de la entrada de contaminación simulada con una incubación de 30 segundos a 25 °C. Dado que la contaminación cruzada suele implicar cantidades de entrada mucho menores, no es necesario extender la incubación. P: ¿Puedo usar las mezclas Luna Probe RT-qPCR para la detección viral? R: Sí, las mezclas Luna Probe RT-qPCR son especialmente adecuadas para la detección sensible de dianas virales, incluida la detección del virus SARS-CoV-2. Puede encontrar ejemplos de cómo se han utilizado Luna y otros productos en nuestra página de investigación sobre la COVID-19. P: ¿Cuáles son las diferencias entre los productos Luna One-Step RT-qPCR (NEB n.° E3006, E3007, M3019, M3029 y L4001)? R: Todos estos productos Luna están optimizados para la RT-qPCR de un solo paso mediante detección de sonda. Los NEB n.° M3019/M0329 son mezclas maestras 4X de un solo tubo. Los productos NEB n.° E3006/E3007 contienen tubos separados para la mezcla de reacción 2X y la mezcla de enzimas 20X. Además, el producto M3019 incluye no solo dUTP, sino también un UDG termolábil para prevenir la contaminación cruzada. NEB #L4001 es una versión liofilizada de NEB#M3019 y está disponible en viales o placas de 96 pocillos. NEB #E3007 y #M3029 carecen de un colorante de referencia pasivo ROX universal. Las mezclas disponibles difieren en cuanto a formato, temperatura de almacenamiento e inclusión de UDG termolábil para prevenir la contaminación cruzada, como se describe en la tabla a continuación. NEB #M3019 Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG NEB #M3029 Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG (sin ROX) NEB #E3006 Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit NEB #E3007 Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (sin ROX) NEB #L4001 LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix con formato UDG Mezcla maestra 4X Mezcla maestra 4X Mezcla de reacción 2X Mezcla de enzimas 20X Mezcla de reacción 2X Mezcla de enzimas 20X Mezcla maestra liofilizada; rehidratar a 2-4X Prevención de arrastre incluida Y (dUTP y UDG termolábil incluidos) Y {dUTP y UDG termolábil incluidos) N (dUTP incluido; requiere adición de UDG) N (dUTP incluido; requiere adición de UDG) Y (dUTP y UDG termolábil incluidos) Colorante de normalización (ROX universal) YNYNY Multiplexación Y (hasta 5-plex) Y (hasta 5-plex) Y (hasta 5-plex) Y (hasta 5-plex) Y (hasta 5-plex) Volumen máximo de muestra (reacción RT-qPCR de 20 µl) hasta 10 µl hasta 10 µl hasta 8 µl hasta 8 µl hasta 10 µl Condición de ciclado estándar 25 °C durante 30 s (tratamiento con UDG); 55 °C durante 10 min; 95 °C durante 1 min; 45 ciclos de 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s, 25 °C durante 30 s (tratamiento UDG); 55 °C durante 10 min; 95 °C durante 1 min; 45 ciclos de 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s, 55 °C durante 10 min; 95 °C durante 1 min; 45 ciclos de 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s, 55 °C durante 10 min; 95 °C durante 1 min; 45 ciclos de 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s, 25 °C durante 30 s (tratamiento UDG); 55 °C durante 10 min; 95 °C durante 1 min; 45 ciclos de 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s. Temperatura de almacenamiento -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C Temperatura ambiente (15 °C a 25 °C) P: Para L4001P, ¿debo utilizar toda la placa Luna en un solo experimento? ¿Cómo se separan los tubos de tira de 8 pocillos? R: La placa de 96 pocillos y las tapas ópticas se proporcionan en un formato desprendible que permite el uso de toda la placa directa o parcialmente. Las doce tiras de 8 pocillos están parcialmente unidas entre sí, por lo que la cantidad necesaria de tubos de tira de 8 pocillos se puede separar rasgando con cuidado la cantidad deseada de tubos de tira. Las tiras de 8 pocillos se encajan en el marco de carcasa amarillo y el adaptador del marco de carcasa amarillo se debe retirar para separar uno o más tubos de tira. Las tiras de 8 pocillos y las tapas están etiquetadas del 1 al 12 en la parte inferior para proporcionar un sistema de seguimiento independiente del adaptador del marco de carcasa amarillo. Consulte la sección Información de la placa y compatibilidad del instrumento en el protocolo para obtener más información. P: Para L4001P: ¿Cómo almaceno los tubos de tira de 8 pocillos sin usar después de abrir la bolsa de aluminio? ¿Durante cuánto tiempo puedo conservar los tubos de tira de 8 pocillos sin usar? R: Cualquier tubo de tira de 8 pocillos sin usar debe volver a sellarse inmediatamente en la bolsa de aluminio con cierre hermético original con el desecante proporcionado y puede almacenarse a temperatura ambiente. Se recomienda utilizar estos tubos dentro de 1 semana de la apertura de la bolsa de aluminio para obtener los mejores resultados. P: Para L4001P: ¿Cuánto tiempo puedo mantener la placa o los tubos de tira de 8 pocillos fuera de la bolsa de aluminio antes de configurar la reacción? R: Después de sacar la placa de la bolsa de aluminio, se recomienda hidratar el reactivo liofilizado que se va a utilizar dentro de 1 hora. P: Para L4001P: ¿Cuál es el propósito del adaptador de carcasa amarilla? R: Los tubos de tira se proporcionan en un adaptador de semifaldón con marco de carcasa amarilla de un solo uso. Este adaptador amarillo tiene un borde biselado en la esquina superior izquierda (A1), lo que facilita su uso en los termocicladores FAST de ABI/Life Technologies® y sistemas robóticos. El marco amarillo proporciona rigidez a la placa, por lo que se recomienda su uso para ciclos completos en los termocicladores FAST de ABI/Life Technologies. Si la placa se va a utilizar parcialmente, se pueden usar tiras individuales de 8 pocillos con o sin el marco amarillo en los termocicladores FAST de ABI/Life Technologies. El uso de otras plataformas de instrumentos (p. ej., Bio-Rad®) requerirá la extracción del adaptador amarillo antes del termociclado. Consulte la sección "Información de la placa y compatibilidad del instrumento" del protocolo para obtener recomendaciones sobre el uso del adaptador amarillo en instrumentos comunes de PCR en tiempo real. P: Para L4001P, ¿puedo reutilizar el adaptador amarillo? R: El adaptador amarillo es de un solo uso para evitar la contaminación cruzada entre ciclos de RT-qPCR. Debe desecharse junto con los tubos de las tiras una vez finalizado el ciclo. Separar las tiras individuales del adaptador de carcasa amarilla después de la amplificación puede provocar la apertura accidental de las tapas y la posible contaminación de los amplicones. Si se necesitan adaptadores de carcasa amarilla adicionales, se pueden adquirir en BIOplastics (código de producto AB19805G). P: Para L4001P: ¿Por qué se incluye una bandeja de cartón en el paquete? R: La bandeja de cartón se incluye en el paquete para sujetar la placa durante el envío. Se puede reciclar al abrir el paquete o se puede utilizar como soporte para la placa durante la configuración a temperatura ambiente.