New England Biolabs, L4401P, LyoPrime WarmStart® Fluorescent LAMP/RT-LAMP Mix (con UDG)

Categorías relacionadas Amplificación isotérmica y aplicaciones de desplazamiento de hebra Amplificación isotérmica mediada por bucle, Preguntas frecuentes sobre amplificación isotérmica P: ¿Cuál es la temperatura óptima de amplificación LAMP/RT-LAMP? R: Recomendamos 65 °C como temperatura inicial de LAMP. Sin embargo, es posible realizar reacciones LAMP y RT-LAMP de 55 a 70 °C, dependiendo de la naturaleza del conjunto de cebadores y los objetivos. P: ¿Cuál es la concentración de Mg++ en la mezcla maestra WarmStart LAMP/RT-LAMP? R: La mezcla maestra 2X contiene 16 mM de MgSO4 y, por lo tanto, 8 mM de MgSO4 en la reacción final 1X. P: ¿Qué tipos de muestras/materiales de entrada son compatibles con las mezclas LAMP/RT-LAMP? R: LAMP suele ser una técnica robusta y tolerante a inhibidores, y la mezcla maestra WarmStart® LAMP/RT-LAMP es capaz de realizar una amplificación directa utilizando una variedad de tipos de muestras. Para obtener la máxima especificidad y sensibilidad, recomendamos ácido nucleico purificado como entrada. La mayoría de los métodos rutinarios de purificación de plantillas son suficientes, como los kits de extracción de ácidos nucleicos Monarch®. Sugerimos usar 2 µl de ácido nucleico extraído para una reacción LAMP de 25 µl. Se pueden tolerar volúmenes de muestra mayores o menores. Las muestras en medios de transporte (VTM o UTM) deben mantenerse a menos de 2 µl (8 % v/v). P: ¿Con qué rapidez puedo esperar un resultado? R: La amplificación de la diana varía según diversos factores, como el diseño del cebador (recomendamos usar la herramienta de diseño de cebadores NEB LAMP), la pureza y la cantidad de la plantilla. Sugerimos comenzar con un tiempo de incubación de 30 minutos. Si se desea, el tiempo se puede acortar a 15-20 minutos con ensayos optimizados o dianas con un alto número de copias. Alternativamente, se puede prolongar hasta 60 minutos para entradas bajas, muestras impuras o ensayos más lentos. Tenga en cuenta que al extender el tiempo de reacción, también se deben monitorizar los NTC para garantizar que no haya falsos positivos. P: ¿Cómo confirmo un resultado positivo? R: Las reacciones LAMP producen una serie de concatémeros que contienen la secuencia diana y que varían en tamaño. Dado que los amplicones LAMP contienen repeticiones de la misma secuencia de ADN, suelen tener una temperatura de fusión única que puede confirmar la amplificación de la diana correcta. Si se utiliza fluorescencia en tiempo real, se puede incluir una curva de fusión o desnaturalización después de la incubación con LAMP. Para más información, consulte la sección "Solución de problemas" del manual del kit WarmStart LAMP. P: ¿Puedo preparar mis reacciones LAMP/RT-LAMP a temperatura ambiente? R: Sí, las enzimas Bst ADN polimerasa y transcriptasa inversa utilizadas en esta mezcla maestra son formulaciones WarmStart®, por lo que son inhibidas por aptámeros modificados a temperatura ambiente. Por lo tanto, las reacciones pueden prepararse a temperatura ambiente sin afectar significativamente la actividad LAMP. Para obtener más información sobre la modulación de la actividad enzimática a temperatura ambiente con aptámeros, consulte "Uso de aptámeros para controlar la actividad enzimática: Hot Start Taq y más allá". P: La mezcla maestra WarmStart LAMP presenta cierta precipitación en el tubo después de descongelarla. ¿Es normal? R: Sí, la precipitación de las mezclas maestras LAMP después de congelarlas/descongelarlas es normal. Es importante resuspender la mezcla mezclándola bien o agitándola en vórtex para disolver todo el precipitado; sin embargo, después de la suspensión, las mezclas maestras pueden usarse con normalidad. P: ¿Cómo diseño cebadores LAMP? R: Diseñar cebadores LAMP manualmente puede ser difícil, por lo que se recomienda encarecidamente el uso de programas informáticos para facilitar el diseño y garantizar el éxito de la reacción. Recomendamos usar la herramienta de diseño de cebadores LAMP de NEB. Dado que el rendimiento y los niveles de amplificación sin molde pueden variar incluso con el diseño in silico, recomendamos evaluar de 2 a 4 conjuntos completos de cebadores LAMP para obtener una sensibilidad y especificidad óptimas antes de elegir el conjunto final. Para obtener una visión general del diseño y uso de los cebadores LAMP, consulte nuestro tutorial de la herramienta de diseño de cebadores LAMP y lea esta nota de aplicación para obtener más información. P: ¿La mezcla maestra WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG) previene la contaminación por arrastre y reduce la contaminación? R: Sí, la mezcla maestra WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG) está formulada con una mezcla de dTTP y dUTP. Esto garantiza una amplificación isotérmica eficiente y la incorporación de dU en los productos de reacción. La mezcla también contiene UDG termolábil antártico (NEB n.° M0372). Los productos LAMP que contienen dU sirven como sustrato para la uracilo ADN glicosilasa, lo que permite prevenir la contaminación por arrastre. Las reacciones deben prepararse a temperatura ambiente (normalmente entre 22 y 25 °C) antes de la incubación isotérmica para permitir la degradación de los amplicones que contienen dU o, si se desea, una incubación de 10 minutos a 25 °C antes de añadir LAMP al flujo de trabajo. Debido a que LAMP puede generar grandes cantidades de ADN en períodos muy cortos de tiempo, las mejores prácticas para reducir la contaminación implican no abrir las reacciones LAMP después de la amplificación. P: La amplificación ocurrió en mi(s) muestra(s) de NTC después de la incubación isotérmica. ¿Qué sucedió? R: La amplificación en el control sin molde dentro de los 30 minutos puede indicar contaminación cruzada durante la configuración de la reacción o un problema sistémico. Algunos conjuntos de cebadores son más susceptibles a la amplificación no específica que otros. Recomendamos evaluar al menos dos conjuntos de cebadores LAMP para cualquier diana dada. Además, algunos formatos de reacción o flujos de trabajo pueden ser más propensos a la amplificación no específica con conjuntos de cebadores particulares como: Grandes volúmenes de reacción en recipientes pequeños (p. ej., 20 µL en placas de 384 pocillos) Bajas temperaturas de reacción (p. ej., 60 °C en lugar de 65 °C) Si se utiliza un termociclador en tiempo real, se puede incluir una curva de fusión o desnaturalización después de la incubación LAMP para distinguir entre la amplificación espuria y la contaminación cruzada, ya que cada amplicón LAMP producirá un perfil de fusión único. Si la reacción de NTC es positiva tras repetir la prueba o realizar cambios en el flujo de trabajo, reemplace todas las existencias de reactivos y limpie el espacio de trabajo con un descontaminante de superficies aceptable, como lejía al 10 % (dilución 1:10 de hipoclorito de sodio comercial al 5,25-6,0 %). P: ¿Se requiere un paso de incubación independiente para RT-LAMP? R: No es necesario un paso de transcripción inversa independiente para realizar RT-LAMP, ya que la transcriptasa inversa WarmStart RTx producirá ADNc durante la incubación isotérmica a 65 °C. P: ¿Qué tipo de purificación se recomienda para los cebadores LAMP? R: Al cribar varios conjuntos de cebadores LAMP para identificar los que ofrecen un rendimiento óptimo para un objetivo determinado, la desalinización estándar suele ser suficiente. Sin embargo, recomendamos la purificación mediante PAGE o HPLC de los cebadores FIP y BIP como mínimo para el ensayo final para garantizar la robustez con respecto al tiempo de detección y la sensibilidad. P: ¿Qué son LAMP y RT-LAMP? A: La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es un método de amplificación isotérmica diseñado para detectar un ácido nucleico diana sin necesidad de equipos sofisticados. Utiliza una ADN polimerasa con desplazamiento de soporte, como la ADN polimerasa Bst, y de 4 a 6 cebadores que reconocen de 6 a 8 regiones distintas del ADN diana para una reacción de amplificación altamente específica. LAMP ofrece alta sensibilidad (hasta fg o <10 copias de la diana) y resultados rápidos: las reacciones pueden realizarse en tan solo 5-10 minutos. Las reacciones pueden realizarse con recursos limitados, utilizando un baño de agua para la incubación y la detección visual de los resultados, o con medición en tiempo real e instrumentos de alto rendimiento. La detección de dianas de ARN se logra simplemente añadiendo una transcriptasa inversa a la reacción LAMP, con RT-LAMP como un flujo de trabajo isotérmico de un solo paso. La transcriptasa inversa WarmStart RTx (NEB n.° M0380) es una ADN polimerasa dirigida por ARN, acoplada a un aptámero de unión reversible que inhibe la actividad RTx por debajo de 40 °C, lo que la hace especialmente adecuada para RT-LAMP. Para obtener más información y ver nuestra oferta de productos LAMP, visite la página de descripción general de la aplicación LAMP. P: ¿Cuál es la concentración del colorante fluorescente LAMP en la mezcla fluorescente LyoPrime WarmStart LAMP/RT-LAMP (con UDG)? R: La mezcla fluorescente LyoPrime WarmStart LAMP/RT-LAMP (con UDG) contiene colorante fluorescente LAMP (NEB n.° B1700) a una concentración 0,5X con una reacción final 1X. El colorante fluorescente se puede detectar mediante el canal SYBR®/FAM de los instrumentos de PCR en tiempo real habituales. P: ¿Cómo se debe almacenar la mezcla LyoPrime LAMP? R: Formato del vial: Antes de su uso, los productos LyoPrime LAMP deben conservarse a temperatura ambiente (15-25 °C), protegidos de la luz (p. ej., en la caja original del producto u otra caja cerrada). El vial de vidrio, la tapa y el tapón de goma son impermeables a la humedad, lo que permite su almacenamiento sin desecante. No es necesario almacenarlos a -20 °C ni se recomienda antes de la rehidratación. Puede encontrar información adicional sobre almacenamiento y rehidratación aquí. Formato de la placa: Antes de su uso, la mezcla LyoPrime LAMP debe conservarse a temperatura ambiente (15-25 °C) sin abrir, en su bolsa de aluminio original. La bolsa de aluminio y el desecante en su interior protegen el reactivo liofilizado de la humedad atmosférica y la luz. Los tubos de tiras no utilizados deben volver a colocarse inmediatamente en la bolsa de aluminio con el desecante, sellando bien el cierre hermético y almacenándolos a temperatura ambiente. Puede encontrar información adicional sobre almacenamiento y rehidratación aquí. P: ¿Cómo rehidrato la mezcla LyoPrime LAMP? ¿Se puede resuspender a una concentración mayor? A: Formato en vial: Para rehidratar la mezcla liofilizada como una mezcla maestra 2X, retire la tapa y el tapón del vial, añada 675 μl de agua libre de nucleasas y mezcle brevemente pipeteando o agitando suavemente con vórtex. La mezcla liofilizada se puede rehidratar hasta 4X para volúmenes de muestra mayores. Sin embargo, la reconstitución a concentraciones superiores a 2X puede afectar negativamente el tiempo de detección de algunas dianas. Consulte también el protocolo para obtener más información. Formato en placa: La mezcla liofilizada de cada pocillo se puede rehidratar directamente con cebadores y plantilla para obtener una mezcla maestra 1X (volumen de reacción de 25 μl). Por lo tanto, se recomienda preparar una mezcla de ensayo que incluya cebadores y se dispense en cada pocillo. Tras añadir la mezcla de ensayo, mezcle brevemente pipeteando o agitando con vórtex utilizando un agitador de microplacas y, a continuación, añada la plantilla. Puede encontrar información sobre la rehidratación en la página del protocolo (aquí) y también se muestra en el vídeo de descripción general del producto. P: Al disolver el producto liofilizado, la solución al principio se ve turbia. ¿Es normal? R: Sí, es normal. El liofilizado en formato vial se disuelve inmediatamente, pero la liberación de aire provoca un aumento temporal de la turbidez. El aire se desgasificará de forma natural en unos 20 segundos o tras una agitación suave en vórtex. En el formato de placa de 96 pocillos, la agitación suave en vórtex disuelve inmediatamente el liofilizado. P: Para L4401P, ¿es necesario utilizar toda la placa LAMP en un solo experimento? ¿Cómo se separan los tubos de tira de 8 pocillos? R: La placa de 96 pocillos y las tapas ópticas se suministran en formato desprendible, lo que permite utilizar toda la placa, directa o parcialmente. Las doce tiras de 8 pocillos están parcialmente unidas entre sí, por lo que se puede separar el número necesario de tubos de tira de 8 pocillos desprendiéndolos con cuidado. Las tiras de 8 pocillos se encajan en el marco amarillo y el adaptador del marco amarillo debe retirarse para separar uno o más tubos de tira. Las tiras de 8 pocillos y sus tapas están etiquetadas del 1 al 12 en la parte inferior para proporcionar un sistema de seguimiento independiente del adaptador del marco amarillo. Consulte la sección "Información de la placa y compatibilidad del instrumento" del protocolo para obtener más información. P: Para L4401P: ¿Cómo conservo los tubos de tiras de 8 pocillos sin usar después de abrir la bolsa de aluminio? ¿Cuánto tiempo puedo conservar los tubos de tiras de 8 pocillos sin usar? R: Los tubos de tiras de 8 pocillos sin usar deben volver a sellarse inmediatamente en la bolsa de aluminio original con cierre hermético y el desecante incluido, y pueden conservarse a temperatura ambiente. Se recomienda utilizar estos tubos en el plazo de una semana tras abrir la bolsa de aluminio para obtener los mejores resultados. P: Para L4401P: ¿Cuánto tiempo puedo mantener la placa o los tubos de tiras de 8 pocillos fuera de la bolsa de aluminio antes de preparar la reacción? R: Después de sacar la placa de la bolsa de aluminio, se recomienda hidratar el reactivo liofilizado que se va a usar en 1 hora. P: Para L4401P: ¿Cuál es el propósito del adaptador de carcasa amarilla? R: Los tubos de tira se proporcionan en un adaptador de carcasa amarilla de un solo uso con semifaldón. Este adaptador amarillo tiene un borde biselado en la esquina superior izquierda (A1), lo que permite el uso del producto en los cicladores FAST de ABI/Life Technologies® y sistemas robóticos. El marco de carcasa amarilla proporciona rigidez a la placa, por lo que se recomienda su uso para ejecuciones de placa completa en los cicladores FAST de ABI/Life Technologies. Si la placa se va a usar parcialmente, se pueden usar tiras individuales de 8 pocillos con o sin el marco de carcasa amarilla en los cicladores FAST de ABI/Life Technologies. El uso de otras plataformas de instrumentos (p. ej., Bio-Rad®) requerirá la extracción del adaptador de carcasa amarilla antes del termociclado. Consulte la sección "Información de la placa y compatibilidad del instrumento" del protocolo para obtener recomendaciones sobre el uso del adaptador de carcasa amarilla en instrumentos comunes de PCR en tiempo real. P: Para L4401P: ¿Puedo reutilizar el adaptador de carcasa amarilla? R: El adaptador de carcasa amarilla es de un solo uso para evitar la contaminación cruzada entre ejecuciones de RT-qPCR. Debe desecharse junto con los tubos de tiras una vez finalizada la ejecución. Separar las tiras individuales del adaptador de carcasa amarilla después de la amplificación puede provocar la apertura accidental de las tapas y posibles casos de contaminación del amplicón. Si se necesitan adaptadores de carcasa amarilla adicionales, se pueden adquirir en BIOplastics (código de producto AB19805G). P: Para L4401P: ¿Por qué hay una bandeja de cartón en el paquete? R: La bandeja de cartón se incluye en el paquete para sujetar la placa durante el envío. Se puede reciclar al abrir el paquete o se puede utilizar como soporte para la placa durante la configuración a temperatura ambiente.