New England Biolabs, M0100S, ARNasa R

Categorías relacionadas ARNasas,, Especificación de modificación de ARN Materiales necesarios pero no suministrados Agua libre de nucleasas (NEB #B1500) Inhibidor de ARNasa, murino (NEB #M0314) (opcional) Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para convertir 75 pmoles de una secuencia de ARN monocatenario de 20 nucleótidos aguas abajo de una horquilla de ADN de 38 nucleótidos en ribonucleótidos solubles en ácido en un volumen de reacción total de 20 μl en 15 minutos a 25 °C. Condiciones de reacción Tampón de reacción 1X RNase R Incubar a 37 °C Tampón de reacción 1X RNase R Tris-HCl 20 mM KCl 100 mM MgCl2 0,1 mM Tampón de almacenamiento NaCl 300 mM Tris-HCl 10 mM EDTA 0,1 mM DTT surfactante 50 % glicerol pH 7,4 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Es activa la RNase R (NEB n.º M0100) a temperaturas distintas de 37 °C? R: Sí, la RNase R es muy activa hasta ~50 °C. Sin embargo, la incubación de ARN a altas temperaturas puede provocar una hidrólisis no deseada del ARN. La actividad de la RNase R se reduce a temperaturas inferiores a 37 °C. P: ¿Es necesario limpiar las muestras de ARN antes de la digestión con la RNase R (NEB n.º M0100)? R: Sí, es necesario purificar las muestras de ARN antes de la digestión con RNasa R, especialmente si contienen una alta concentración de EDTA. La RNasa R es una exorribonucleasa dependiente de magnesio. Recomendamos que las muestras de ARN contengan menos de 0,1 mM de EDTA antes del tratamiento con RNasa R. P: ¿Qué longitud debe tener el saliente de ARN monocatenario 3' para que la RNasa R (NEB #M0100) se una? R: La RNasa R prefiere salientes de ARN monocatenario 3' de al menos 10 nt de longitud. Los salientes más largos, como las colas de poli(A), tienden a resultar en una mayor actividad de la RNasa R. Es posible que la RNasa R no se una a salientes de menos de 10 nt. P: ¿Se puede inactivar térmicamente la RNasa R (NEB #M0100)? R: Sí, la RNasa R se puede inactivar térmicamente a 60 °C durante 10 minutos. Sin embargo, recomendamos inactivar la ARNasa R añadiendo EDTA (concentración final de 10 mM) para evitar la hidrólisis no deseada del ARN. P: ¿Qué son los ARN circulares? R: Los ARN circulares son ARN monocatenarios que forman un bucle cerrado covalentemente. Estos ARN son resistentes a las exoribonucleasas, como la ARNasa R (NEB #M0100), porque no hay un extremo libre al que estas exoribonucleasas se puedan unir. Esta resistencia a las exoribonucleasas hace que los ARN circulares sean más estables que sus homólogos lineales. P: ¿Tiene la ARNasa R (NEB #M0100) actividad estrella? R: Sí, añadir una alta concentración de ARNasa R a muestras de ARN circular puede provocar la degradación del ARN circular. Recomendamos 1 unidad de NEB RNase R por microgramo de ARN (proporción 1:1) para evitar la actividad estrella. P: ¿Es posible digerir los ARN lineales resistentes a la ARNasa R (NEB #M0100)? R: Sí, hemos probado dos métodos para digerir ARN lineales resistentes a la ARNasa R: Recomendamos añadir 1 unidad de ARNasa R, 1 unidad de XRN-1 (NEB n.° M0338) y 5 unidades de RppH (NEB n.° M0356) a 1 µg de muestra de ARN en tampón de reacción de ARNasa R 1X. La reacción debe incubarse durante 15 o 30 minutos a 37 °C para una eliminación eficiente del ARN lineal. Pretrate las muestras de ARN con polimerasa de E. coli (NEB n.° M0276) para alargar los extremos 3' de los ARN, lo que puede mejorar la unión y la actividad de la ARNasa R. El ARN debe purificarse antes de proceder con la reacción de la ARNasa R. P: ¿Se puede almacenar la ARNasa R diluida en tampón de reacción 1X a 4 °C? R: Sí. Las pruebas funcionales confirman que la ARNasa R diluida en tampón de reacción de ARNasa R 1X no muestra una pérdida significativa de actividad hasta por una semana cuando se almacena a 4 °C.