New England Biolabs, M0201S, polinucleótido quinasa T4

Categorías relacionadas Etiquetado de ADN, Aplicaciones de quinasas Fosforilación (quinasa) Especificación Unidad Definición Una unidad de enzima cataliza la fosforilación de 20 pmol de oligo marcado con fluorescencia en 30 minutos a 37 °C. Condiciones de reacción Tampón de reacción de polinucleótido quinasa T4 1X Incubar a 37 °C Tampón de reacción de polinucleótido quinasa T4 1X Tris-HCl 70 mM MgCl2 10 mM DTT 5 mM (pH 7,6 a 25 °C) Concentración de uso 10 000 unidades/ml Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM KCl 50 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Glicerol al 50 % ATP 0,1 µM pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Qué factores pueden causar una fosforilación incompleta cuando se utiliza la polinucleótido quinasa T4? R: La causa más probable de la fosforilación incompleta es el DTT oxidado en el tampón de reacción de la polinucleótido quinasa T4 (PNK) (la oxidación del DTT se produce de forma natural y se acelera mediante ciclos repetidos de congelación/descongelación o un calentamiento excesivo). Utilice un tampón nuevo (< 1 año) o añada DTT nuevo a 5 mM utilizando una solución madre de 1 M. Otros factores incluyen: a. Un exceso de iones de sal, fosfato o amonio presentes: la PNK se inhibe con niveles elevados de sal (50 % de inhibición con NaCl 150 mM), fosfato (50 % de inhibición con fosfato 7 mM) e iones de amonio (75 % inhibidos con (NH4)2SO4 7 mM). El tampón de reacción ThermoPol de NEB contiene (NH4)2SO4 10 mM que se debe eliminar antes de realizar una reacción de quinasa. El ADN no se debe precipitar en presencia de iones de amonio antes de la fosforilación. Realice una diálisis gota a gota o utilice una columna de centrifugación disponible comercialmente para eliminar la sal de la muestra. b. Pequeños contaminantes de ácidos nucleicos en la preparación de ADN: es importante que el sustrato se purifique mediante selección de tamaño para eliminar los contaminantes de ácidos nucleicos de bajo peso molecular que pueden representar un alto porcentaje de los extremos 5'-OH totales, incluso si la masa total es baja. Utilice una columna de centrifugación disponible comercialmente para eliminar estos contaminantes, así como el exceso de sal. c. El extremo está hundido o romo: si los extremos tienen extremos romos o hundidos en 5', caliente la mezcla de sustrato/tampón durante 10 minutos a 70 °C, enfríe rápidamente en hielo antes de agregar el ATP y la enzima, luego incube a 37 °C. Esto ayuda a que la PNK acceda a los extremos 5'-OH. d. La fosfatasa no se inactivó: para eliminar CIP o BAP, use fenol/CHCl3. Quick CIP, Antarctic Phosphatase y rSAP se pueden inactivar por calor. e. ATP no añadido: la PNK requiere ATP para la actividad. Normalmente, las reacciones de PNK son seguidas por una reacción de ligación. Para simplificar este proceso, la PNK está optimizada para su uso en el tampón de reacción de la ligasa T4 (que contiene la cantidad adecuada de ATP). Recomendamos realizar la reacción de PNK en el tampón de ligasa durante 30 minutos; usted puede entonces proceder a la ligación sin un cambio de tampón o inactivación por calor; sin embargo PNK permanecerá activo en la reacción subsiguiente a menos que se inactive por calor o se elimine (columna de centrifugación, purificación en gel) antes del siguiente paso. P: ¿Puedo usar T4 Polynucleotide Kinase y T4 DNA Ligase en el mismo tampón de reacción? R: Sí, para fosforilaciones no radiactivas, pero no para reacciones de marcaje radiactivo ya que el ATP no radiactivo en el tampón T4 Ligase interferirá con el marcaje. P: ¿Cómo se puede mejorar la tasa de fosforilación cuando se usa T4 Polynucleotide Kinase? R: a. Si trabaja con extremos 5'-retraídos, caliente la mezcla de reacción durante 10 min a 70 °C, enfríe rápidamente en hielo antes de agregar el ATP (o tampón Ligasa que contenga ATP) y la enzima, luego incube a 37 °C. b. Agregue PEG a la reacción. La adición de PEG 8000 al 5% final (p/v) puede mejorar los resultados. c. Agregue espermidina. La espermidina mejorará las reacciones aproximadamente un 20-30%, pero no se utiliza en la determinación de la unidad y no es necesaria para la actividad completa. d. Utilice un tampón alternativo para la reacción de intercambio. Se pueden lograr mayores niveles de incorporación en la reacción de intercambio utilizando un tampón que contenga 50 mM de imidazol-Cl (pH 6,4), 10 mM de MgCl₂ y 5 mM de DTT (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, segunda edición, págs. 10.59-10.67, 11.31-11.33, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). NEB no suministra este tampón. P: ¿Necesito desfosforilar antes del marcaje? R: No necesariamente. La reacción de intercambio da resultados aceptables, pero desfosforilar primero, seguido de la reacción directa, da la mejor incorporación. P: ¿Cuánto sustrato se puede fosforilar en una reacción estándar? R: Hasta 350 pmol de extremos 5' para fosforilación en frío y hasta 50 pmol para fosforilación en caliente. Nota: 1 µg de un 20 mer = 150 pmol de extremos 5'. Ejemplo, para calcular el número de pmol en 1 µg de un 30 mer: 150 pmol X (20 mer/30 mer) = 100 pmol P: ¿Cuántas unidades de T4 Polynucleotide Kinase deben usarse para una reacción típica? R: Normalmente, 10 unidades para una reacción en frío y 20 unidades para una reacción de marcaje en caliente. Dado que el [sustrato] y el [ATP] están por debajo de la Km en una reacción en caliente, se requieren más unidades. La determinación de la unidad se realiza en condiciones ideales donde las concentraciones de sustrato y ATP están por encima de sus Km. P: ¿Cómo inactivo la enzima? R: La incubación durante 20 minutos a 65 °C inactiva completamente la polinucleótido quinasa T4. P: ¿Cómo calcular la molaridad de los extremos? R: NEB sugiere usar la herramienta en línea gratuita NEBioCalculator. Esta herramienta calcula la molaridad de los extremos, así como otros cálculos biomatemáticos. Si desea calcular "a mano", tenga en cuenta lo siguiente: Molaridad = [(µg/µl) ÷ (pares de bases x 650 daltons)] x 2 extremos Ejemplo: Calcule la molaridad de los extremos para un vector linealizado de 5 kb que tiene una concentración de 250 ng/µl: [(0,25 µg/µl) ÷ (5000 x 650 daltons)] x 2 = 154 nM Calcule la molaridad de los extremos si pone 50 ng de este vector en una reacción de ligadura de 20 µl: 50 ng ÷ 20 µl = 0,0025 µg/µl [(0,0025 µg/µl) ÷ (5000 x 650)] x 2 = 1,54 nM Determine la cantidad de un Se necesita un inserto de 1 kb para lograr una relación inserto:vector de 3:1: 3 X 1,54 nM = 4,62 nM [(X µg/µl) ÷ (1000 x 650)] x 2 = 4,62 nM 0,0015 µg/µl x 20 µl = 0,03 µg = 30 ng ¿Esta reacción se encuentra dentro del rango óptimo de 1–10 µg/ml? (50 ng de vector + 30 ng de inserto) ÷ 20 µl = 4 µg/ml P: ¿Qué marcadores se pueden usar? R: Fosforilar con 32P-ATP o 33P-ATP (35S no funciona como donante). Debido a las bajas emisiones de energía de 33P-ATP, las películas deben exponerse durante períodos prolongados. Las mediciones de centelleo funcionan bien con 33P-ATP. P: ¿Funcionará la polinucleótido quinasa T4 en el tampón rCutSmart? R: La polinucleótido quinasa T4 funcionará en el tampón rCutSmart, con la adición de ATP y DTT. Para ver su porcentaje de actividad funcional en rCutSmart y el de otras enzimas modificadoras de ADN en el proceso de clonación, consulte la tabla de actividad de las enzimas modificadoras de ADN en el tampón rCutSmart®.