New England Biolabs, M0202S, Ligasa de ADN T4

¿Busca formulaciones y variantes adicionales de la ADN ligasa T4? Categorías relacionadas: Aplicaciones de las ADN ligasas: BioBrick®, Ensamblaje, Clonación, Ligación, NEBridge® Golden Gate, Especificación del ensamblaje. Definición de la unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para lograr una ligación del 50 % de los fragmentos HindIII de ADN λ (concentración de 0,12 µM en el extremo 5' del ADN, 300 µg/ml) en un volumen total de reacción de 20 µl en 30 minutos a 16 °C en tampón de reacción de la ADN ligasa T4 1X. Concentración: 400.000 unidades de extremo cohesivo/ml y 2.000.000 de unidades de extremo cohesivo/ml Condiciones de reacción Tampón de reacción de la ligasa de ADN T4 1X Incubar a 16 °C Tampón de reacción de la ligasa de ADN T4 1X Tris-HCl 50 mM MgCl2 10 mM ATP 1 mM DTT 10 mM (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM KCl 50 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Glicerol al 50 % pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Cuáles son algunos de los posibles problemas con la reacción de ligación utilizando la ligasa de ADN T4 que pueden provocar un fallo en la transformación? R: * La ligación falló porque no había ATP ni Mg2+. Utilice el tampón suministrado o añada ATP a un tampón compatible. El ATP en buffers de más de un año puede haberse degradado lo suficiente como para causar problemas. Cuando se suplementa con ATP, asegúrese de usar ribo ATP ya que el desoxirribo ATP no funcionará. * La ligadura falló debido a un alto contenido de sal o EDTA en la reacción. Limpie el ADN. * CIP, BAP o SAP no se inactivaron completamente del paso de desfosforilación. Siga el procedimiento recomendado para eliminar la fosfatasa. * La ligadura produjo solo ADN lineal porque la concentración de ADN era demasiado alta. Mantenga la concentración total de ADN entre 1-10 μg/ml. * El extremo ligado fue una única base saliente. Use hasta 5 μl de ligasa concentrada a 16 °C durante la noche. * El inserto y el plásmido no tienen fosfatos. Nota: los cebadores pueden no tener fosfatos, lo que provoca problemas de ligadura de extremos romos en vectores CIPeados. Ordene cebadores con fosfatos o quinase los cebadores. * Se agregó demasiada mezcla de ligadura a las células. Agregue entre 1-5 μl a 50 μl de células competentes. * El inserto era grande y las condiciones no permitieron la circularización. Reduzca la concentración del inserto y use ligasa concentrada a 16 °C durante la noche. * La ligasa estaba inactiva. Pruebe en lambda HindIII u otro sustrato conveniente. * La mezcla de ligación contenía PEG y se incubó durante la noche. La ligación extendida con PEG causa una caída en la eficiencia de la transformación. Esto podría deberse a la producción gradual de grandes piezas lineales de ADN que pueden inhibir la transformación. El tampón para el Quick Ligation Kit (NEB # M2200) contiene PEG. * La mezcla de ligación no se purificó antes de la electroporación. El tampón debe eliminarse o la sal generará una chispa. Dialice la muestra o use una columna de centrifugación para purificarla. El PEG en el tampón del Quick Ligation Kit (NEB # M2200) evita la chispa, pero también previene la electroporación. El PEG debe eliminarse usando una columna de centrifugación. P: ¿Qué problemas se pueden encontrar en la digestión de restricción que pueden causar que la ligadura usando T4 ADN Ligasa o la transformación posterior falle? R: * La enzima de restricción no escindió eficientemente. Si se escinde cerca del final de un fragmento de PCR * deje al menos 6 bases más allá del sitio de restricción. Pruebe la enzima de restricción en un sustrato de control. * La enzima de restricción no se inactivó completamente. El fenol/ETOH purifica el ADN si la enzima no se puede inactivar por calor. * La actividad estrella de la digestión de restricción escindió el vector o inserto. Verifique el ADN en un gel. Si hay una banda adicional, reduzca la cantidad de enzima o el tiempo para la digestión de restricción. * El ADN o la enzima de restricción contenían exonucleasa o fosfatasa que dañaron los extremos. El fenol/ETOH purifica el ADN. Verifique los datos y notas de QC de la enzima. Si el QC de la ligadura es deficiente o el nivel de exonucleasa es alto, reduzca la cantidad de enzima o el tiempo de incubación. * El proceso de PCR está cubierto por patentes propiedad de Roche Molecular Systems, Inc. P: ¿Qué controles se deben ejecutar para probar las células y el ADN cuando se utiliza la ADN ligasa T4? R: Nota: Use la misma concentración de ADN para cada control, típicamente 0,1 -1,0 ng por transformación. 1. La transformación del vector sin cortar en las células competentes verifica la viabilidad celular y prueba la resistencia a los antibióticos del plásmido. Sembrar en medio y medio más antibiótico. 2. El vector linealizado prueba el fondo debido al plásmido sin cortar. Debe ser <1% del valor obtenido en 1. 3. El plásmido cortado y religado prueba la actividad de la ligasa y la integridad del extremo del ADN. Debe ser cercano al valor obtenido en 1. 4. El plásmido cortado, fosfatasado y religado prueba el fondo debido al tratamiento incompleto con fosfatasa. Debe ser <1% del valor obtenido en 1. P: ¿Cuándo debe ser la ADN ligasa T4 la enzima de elección? R: La ADN ligasa T4 debe usarse para ligar extremos cohesivos (10 minutos a temperatura ambiente) o romos (2 horas a temperatura ambiente) o si la ligadura se realizará durante la noche. Si se requiere inactivación por calor, se debe usar la ADN ligasa T4. Se recomienda la ADN ligasa T4 concentrada para ligar salientes de una sola base o para construcciones grandes que requieren tiempos de incubación más largos para circularizar, como la construcción de BAC (cromosoma artificial bacteriano). P: ¿Se puede usar la ADN ligasa T4 con el tampón Quick Ligase? R: Sí, se puede sustituir directamente por la ADN ligasa T4 concentrada. Al usar la ADN ligasa T4 regular, aumente el tiempo de reacción de 5 a 15 minutos. No detenga la reacción con calor, ya que el tratamiento térmico del PEG en el tampón de reacción Quick Ligase inhibirá la transformación. La eficiencia de la transformación también disminuirá si se extiende el tiempo de reacción. P: ¿Cuál es la definición de una unidad Weiss y una unidad de extremo cohesivo? R: Una unidad Weiss se basa en la reacción de intercambio de ATP-PPi catalizada por la ADN ligasa T4, descrita por Bernard Weiss, Charles Richardson y colegas (Weiss, B., et. al., (1968) J. Biol. Chem., 243, 4556). Una unidad Weiss se define como la cantidad de enzima necesaria para convertir 1 nmol de pirofosfato inorgánico marcado con ³²P en material adsorbible de Norit en 20 minutos a 37 °C, en condiciones de reacción específicas (Weiss, B., et. al., (1968) J. Biol. Chem., 243, 4543). Norit es un tipo de carbón activado. Una unidad cohesiva terminal se define como la cantidad de enzima requerida para dar una ligadura del 50% de los fragmentos Hind III del ADN lambda (concentración de los extremos 5' del ADN de 0,12 µM (300 µg/ml)) en 20 µl de tampón 1X T4 ADN ligasa en 30 minutos a 16 °C. P: ¿Cuál es la diferencia entre las dos definiciones y por qué NEB utiliza la unidad cohesiva terminal? R: La unidad Weiss no es una medición directa de la ligadura del ADN; es una medición indirecta de la reacción de adenilación de la enzima, seguida de la determinación del intercambio de ATP-PPi. NEB no pensó que la unidad Weiss fuera lo suficientemente informativa, porque el uso más frecuente de la ADN ligasa T4 es para la ligadura del ADN. Como la unidad cohesiva terminal implica la medición directa de la ligadura del ADN, NEB cree que es más relevante en la práctica. P: ¿Cuánto ADN se debe utilizar en una ligadura utilizando la ADN ligasa T4? R: La definición de la unidad utiliza fragmentos lambda HindIII de 0,12 μM (300 μg/ml). La alta concentración de ADN puede utilizarse para la ligadura del enlazador. Para promover la formación de círculos, útil en la transformación, se debe utilizar una concentración total de ADN menor. La concentración total de vector + inserto debe estar entre 1 y 10 μg/ml para una ligadura eficiente. Se recomiendan proporciones molares de vector:inserto entre 1:1 y 1:10 (1:3 es lo típico). Si no está seguro de sus concentraciones de ADN, realice múltiples ligaduras con proporciones variables. P: ¿Se puede utilizar la ADN ligasa T4 en otros NEBuffers, incluido rCutSmart? R: La ligadura también se puede realizar en cualquiera de los NEBuffers de endonucleasas de restricción estándar, incluido el tampón rCutSmart®, o en el tampón de polinucleótido quinasa T4 si se complementa con 1 mM de ATP. Asegúrese de usar riboATP (NEB n.° P0756), ya que el desoxirriboATP no funcionará. Al usar NEBuffer 3 o r3.1, los altos niveles de sal en la preparación de ADN pueden reducir la eficiencia de la ligación. Para ver su porcentaje de actividad funcional en rCutsmart y el de otras enzimas modificadoras de ADN en el flujo de trabajo de clonación, consulte la tabla de actividad de las enzimas modificadoras de ADN en el tampón rCutSmart®. P: ¿Se puede inactivar la ADN ligasa T4 por calor? R: Sí, caliente a 65 °C durante 10 minutos. No inactive por calor si hay PEG en el tampón de reacción (tampón del kit de ligación rápida NEB n.° M2200), ya que se inhibirá la transformación.