New England Biolabs, M0204S, ARN ligasa T4 1 (ligasa de ARNmc)

También hay disponible una versión de alta concentración (30 000 unidades/ml) de esta enzima, T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase), Alta concentración ( Categorías relacionadas Aplicaciones de ligadura de ARN Clonación de ARN Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Agua libre de nucleasas (NEB n.º B1500) Inhibidor de ARNasa, murino (NEB n.º M0314) (opcional) Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para convertir 1 nanomol de rA16 marcado con fluorescencia en una forma resistente a la fosfatasa en 30 minutos a 37 °C. Condiciones de reacción 1X tampón de reacción de T4 RNA Ligase Suplemento con 1 mM de ATP Incubar a 25 °C 1X tampón de reacción de T4 RNA Ligase 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT (pH 7,5 a 25 °C) Almacenamiento Tampón Tris-HCl 10 mM KCl 50 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Glicerol al 50 % pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 15 minutos Condiciones del ensayo unitario Se mezcla tampón de reacción de la ARN ligasa T4 1X, suplementado con ATP 1 mM, con el sustrato de ARN (10 µM de rA16 marcado con fluorescencia) y cantidades variables de enzima. La incubación se realiza a 37 °C durante 15 minutos (8). Concentración: 10 000 unidades/ml Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la temperatura y el tiempo de reacción óptimos para la ARN ligasa T4 I? R: En general, un mayor tiempo de reacción y una menor temperatura de reacción producen reacciones de ligadura más completas. Una reacción de ligadura típica debe llevarse a cabo a 25 °C durante un máximo de 2 horas. Para oligos más largos, 2 horas de incubación a 25 °C seguidas de una incubación durante la noche a 16 °C puede mejorar el rendimiento. P: ¿Se puede usar la ARN ligasa 1 de T4 para marcar los extremos de ADN o ARN monocatenario? R: La ARN ligasa 1 de T4 se puede usar para marcar el extremo 3' del ARN monocatenario. La transferasa terminal (#M0315) se puede usar para marcar el extremo 3' del ADN monocatenario. La T4 PNK (#M0201) se puede usar para marcar el extremo 5' del ADN monocatenario. P: ¿La ARN ligasa 1 de T4 ligará el ADN bicatenario? R: No, no significativamente. Contrariamente a los primeros informes, la ARN ligasa 1 de T4 no mejora significativamente la ligadura de extremos romos cuando se usa con la ADN ligasa 1 de T4. (1). (1) Sugino, A. et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 3987-3994. P: ¿Cuál es la causa más común de fallo de ligadura cuando se usa la ARN ligasa 1 de T4? R: La estructura secundaria del ARN que protege los extremos puede inhibir la ligadura. La adición de DMSO al 10 % (v/v) puede aumentar la ligadura en estos casos. P: ¿Por qué el nuevo tampón de reacción de la ARN ligasa T4 no contiene ATP? R: Para ofrecer a los clientes mayor flexibilidad en el uso de este producto, ahora ofrecemos soluciones de ATP 10 mM y PEG8000 al 50 % como componentes separados del tampón enzimático. El tampón de reacción de la ARN ligasa T4 (NEB n.° B0216) también es compatible con la ARN ligasa T4 2 truncada (NEB n.° M0242) y la ARN ligasa T4 2 truncada K227Q (NEB n.° M0351). P: ¿La reacción de ligadura con la ARN ligasa T4 1 producirá círculos o productos dúplex? R: La reacción puede producir ambos. La unidad se define por la producción de círculos utilizando rA-20mer como sustrato. Aumentar la concentración y la longitud, y añadir PEG, puede aumentar el número. de ligaduras intermoleculares. Bloquear un extremo de la molécula con un terminador didesoxi evitará que la molécula forme un círculo. P: ¿Se puede usar la ARN ligasa 1 de T4 para crear híbridos de ARN/ADN monocatenarios? R: Sí. P: ¿Puede la ARN ligasa 1 de T4 ligar trifosfatos? R: No. Sin embargo, el ARN se puede tratar primero con CIP para eliminar el trifosfato y luego con una quinasa para añadir un solo fosfato. Los fragmentos que contienen estos monofosfatos 5' se pueden ligar mediante la ARN ligasa 1 de T4. P: ¿Se puede usar la ARN ligasa 1 de T4 para añadir colas al ADN dúplex lineal? R: Sí, los oligos de ARN se pueden ligar a ADN dúplex de extremo romo o cohesivo. Los oligos de ADN se ligan a una velocidad muy reducida (3). (3) Higgins, NP et al. (1979) NAR 6, págs. 1013-1024. P: ¿Puede un didesoxi ¿Se puede usar para bloquear la ligadura con la ARN ligasa 1 de T4? R: Sí (2). (2) Troutt, AB, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, págs. 9823-9825. P: ¿Se puede usar la ARN ligasa 1 de T4 para incorporar aminoácidos artificiales a las proteínas? R: Sí, véase la referencia Noren, CJ et al. (1989) Science 244, 182-188. P: ¿Mejorará el PEG la ligadura con la ARN ligasa 1 de T4? R: Sí (4), el tampón del kit de ligadura rápida (NEB n.° M2200) se puede usar con la ARN ligasa 1 de T4. (4) Harrison, B. y Zimmerman, SB, (1984) NAR 12, 8235-8251. P: ¿La ARN ligasa 1 de T4 ligará el ADN monocatenario? R: Sí. La reacción es Más lento que el ARN/ARN o el ARN/ADN. Por ejemplo, los cebadores pueden ligarse al ADNc (2). (2) Troutt, AB, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, págs. 9823-9825. P: ¿Está disponible el PEG 8000 para su compra? R: El PEG 8000 se incluye como componente del tampón de reacción de la ARN ligasa T4 (NEB n.° B0216). P: ¿Cuál es la tolerancia a la sal de esta ARN ligasa? R: NEB n.° ARN ligasa Tolerancia a la sal M0204 ARN ligasa T4 1 (ssRNA ligasa) ≤ 50 mM M0239 ARN ligasa T4 2 (dsRNA ligasa) ≤ 50 mM M0242 ARN ligasa T4 2, truncada ≤ 100 mM M0351 T4 ARN ligasa 2, trunc. K277Q ≤ 100 mM M0373 T4 ARN ligasa 2, trunc. KQ ≤ 100 mM M0375 SplintR Ligasa ≤ 50 mM E2610 5' Adenylation Kit (Mth Ligasa) ≤ 300 mM M0319 Termoestable 5' App ADN/ARN Ligasa ≤ 50 mM