New England Biolabs, M0205S, Ligasa de ADN de E. coli

La ADN ligasa ligará estos sustratos: Categorías relacionadas Aplicaciones de las ADN ligasas Ligadura sin clonación Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para dar una ligadura del 50% de los fragmentos HindIII de ADN λ (concentración de extremos de ADN 5' de 0,12 μM, 300 μg/ml) en un volumen de reacción total de 20 μl en 30 minutos a 16 °C en tampón de reacción de ADN ligasa de E. coli 1X. Condiciones de reacción 1X Tampón de reacción de ligasa de ADN de E. coli Incubar a 16 °C 1X Tampón de reacción de ligasa de ADN de E. coli 30 mM Tris-HCl 4 mM MgCl2 26 µM NAD 1 mM DTT 50 µg/ml Albúmina recombinante (pH 8 a 25 °C) Concentración de uso 10 000 unidades/ml Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Preguntas frecuentes P: ¿En qué se diferencia la ligasa de ADN de E. coli (NEB n.º M0205) de la ligasa de ADN T4 (NEB n.º M0202)? R: Bajo las condiciones recomendadas, la ADN ligasa de E. coli no unirá extremos romos ni ADN con ARN. La ADN ligasa de E. coli es más específica para extremos cohesivos que la ADN ligasa T4. P: ¿Qué ligasa debo usar? R: El Quick Ligation Kit (NEB #M2200) debe usarse si el tiempo es un factor, especialmente si la ligadura involucra extremos romos (RT de 5 minutos). La ADN ligasa T4 (NEB #M0202) es la enzima de elección para la mayoría de las aplicaciones de ADN recombinante. Puede usarse para extremos cohesivos (RT de 10 minutos) y extremos romos (RT de 2 horas) o si la ligadura se va a realizar durante la noche. La eficiencia de la transformación puede disminuir si el Quick Ligation Kit se usa durante la noche. Use la ADN ligasa T4 si se requiere inactivación por calor. Se requiere una columna de centrifugación para la eliminación de PEG del Quick Ligation Kit antes de la electroporación. Se sugiere la ligasa concentrada para ligar salientes de una sola base. Las construcciones grandes, como los BAC (cromosomas artificiales bacterianos), que requieren tiempos de incubación más largos para circularizarse, se benefician de la ligasa de alta concentración. Utilice la ADN ligasa de E. coli (NEB n.° M0205) si se desea la ligadura de extremos cohesivos, a la vez que se suprime la ligadura de extremos romos o la ligadura al ARN. La ADN ligasa de E. coli es más específica para extremos cohesivos que la ADN ligasa T4. Utilice la ARN ligasa T4 (NEB n.° M0204) si el objetivo es ligar ADN o ARN monocatenario. P: ¿Funcionará la ADN ligasa de E. coli en el tampón rCutSmart? R: La ADN ligasa de E. coli funcionará en el tampón rCutSmart, con la adición de NAD+. Para ver su porcentaje de actividad funcional en rCutSmart y el de otras enzimas modificadoras de ADN en el flujo de trabajo de clonación, consulte la tabla "Actividad de las enzimas modificadoras de ADN en el tampón rCutSmart®".