New England Biolabs, M0207S, ARN polimerasa SP6

La ARN polimerasa SP6 se ​​utiliza para Categorías relacionadas Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas, Síntesis de ARN Transcripción in vitro (IVT), Soluciones de nucleótidos para aplicaciones de ARN Especificación de PCR Materiales necesarios pero no suministrados Inhibidor de ARNasa, murino (NEB #M0314) (opcional) Mezcla de solución de ribonucleótidos (NEB #N0466) DTT fresco (opcional) Agua libre de nucleasas (NEB #B1500) Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para incorporar 1 nmol de ATP en un material insoluble en ácido en 1 hora a 37 °C. Condiciones de reacción 1X tampón de reacción RNAPol suplementado con 0,5 mM de ATP, 0,5 mM de GTP, 0,5 mM de UTP y 0,5 mM de CTP Incubar a 37 °C 1X tampón de reacción RNAPol 40 mM de Tris-HCl 6 mM de MgCl2 1 mM de DTT 2 mM de espermidina (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 50 mM de Tris-HCl 100 mM de NaCl 20 mM de β-ME 1 mM de EDTA 50 % de glicerol al 0,1 % (p/v) Triton® X-100 pH 7,9 a 25 °C Condiciones del ensayo unitario 1X tampón de reacción RNAPol, suplementado con 0,5 mM de cada uno de ATP, UTP, GTP, CTP y 1 μg de ADN que contiene el promotor SP6 en 50 μl. Preguntas frecuentes P: ¿La reacción de transcripción con la ARN polimerasa SP6 requiere un cebador? R: No, la ARN polimerasa SP6 reconoce su secuencia promotora específica e inicia la transcripción en la G final. La polimerasa luego transcribe usando la cadena opuesta como plantilla de 5'->3'. P: ¿La ARN polimerasa SP6 deja una base adicional al final de una transcripción? R: Sí, la ARN polimerasa SP6 puede agregar una o algunas bases adicionales al final de una transcripción produciendo un grupo de transcripciones con extremos 3' heterogéneos. P: ¿La ARN polimerasa SP6 funcionará en un sustrato monocatenario? R: No, la región de la secuencia promotora debe ser bicatenaria. P: ¿La ARN polimerasa SP6 funcionará en ADN plasmídico sin cortar? R: Sí, pero la ARN polimerasa SP6 es una enzima extremadamente procesiva y continuará transcribiendo alrededor de una plantilla circular varias veces sin disociarse. El plásmido se puede linealizar con una enzima de restricción que deja un saliente romo o 5' aguas abajo del ADN de interés. P: ¿Se puede producir ARN aberrante al usar la ARN polimerasa SP6? R: Se ha observado ARN aberrante cuando la enzima de restricción utilizada para linealizar el plásmido aguas abajo del ADN de interés produce un saliente 3'. Para evitar esto, el plásmido debe cortarse con una enzima de restricción que deje un saliente romo o 5' aguas abajo del ADN de interés. P: ¿Puedo usar la ARN polimerasa SP6 para crear sondas radiomarcadas de alta actividad específica? R: Sí, se pueden usar la ARN polimerasa T7, la ARN polimerasa SP6, la ARN polimerasa T3 y el kit HiScribe T7 (NEB n.° E2040) para crear sondas de ARN. Se puede obtener una mayor sensibilidad de detección de ácidos nucleicos usando una sonda de ARN debido a la mayor estabilidad de los híbridos ARN/ADN que de los híbridos ADN/ADN. P: ¿Por qué la actividad específica de la sonda es baja? R: La concentración del nucleótido radiactivo debe ser limitante (6 μM). En otras palabras, si se utiliza ATP marcado, se deben añadir 500 μM de UTP, CTP y GTP, pero solo 6 μM de ATP en la transcripción para que el ATP se incorpore en un mayor porcentaje, lo que resulta en una sonda de ARN muy caliente. P: ¿Cuáles son las principales causas de fallo en la reacción utilizando la ARN polimerasa SP6? R: La ARN polimerasa SP6 es extremadamente sensible a la inhibición salina. La concentración de sal monovalente no debe superar los 20 mM. El molde de ADN debe prepararse sin sal. La contaminación con ARNasa degradó el producto de ARN. Recomendamos utilizar inhibidor de ARNasa (NEB n.° 0314 o n.° M0307) en la reacción a 1 unidad/ul. Utilice agua ultrapura y asegúrese de que el molde de ADN se haya extraído con fenol/cloroformo.