New England Biolabs, M0208L, Taq ADN ligasa

La ADN ligasa se ha reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10233580. Categorías relacionadas ADN ligasas Aplicaciones Ensamblaje Gibson,, Clonación Especificación de ligadura Definición de unidad (unidad de extremo cohesivo) Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para dar una ligadura del 50 % de los extremos cohesivos de 12 pares de bases de 1 µg de ADN λ digerido con BstEII en un volumen de reacción total de 50 μl en 15 minutos a 45 °C. Condiciones de reacción Tampón de reacción de ADN ligasa Taq 1X Incubar a 45 °C Tampón de reacción de ADN ligasa Taq 1X Tris-HCl 20 mM Acetato de potasio 25 mM Acetato de magnesio 10 mM NAD 1 10 mM DTT 0,1 % Triton® X-100 (pH 7,3 a 25 °C) Concentración de uso 40 000 unidades/ml Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM KCl 50 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor Sin unidad Condiciones de ensayo Tampón de reacción de ADN ligasa Taq 1X y ADN (20 µg/ml). Después de la incubación a 45 °C durante 15 minutos, la reacción se termina mediante la adición de colorante de parada (glicerol al 50 %, EDTA 50 mM y azul de bromofenol), se calienta a 70 °C durante 10 minutos y luego se carga en un gel de agarosa al 0,7 %. Debido a la presencia de ligasa, los extremos cos del ADN λ digerido con BstEII permanecerán juntos después del tratamiento térmico a 70 °C. Preguntas frecuentes P: ¿Se utiliza la ADN ligasa Taq para una técnica especial? R: Sí. Se utiliza en LCR (reacción en cadena de la ligasa) y LDR (reacción de detección de ligasa). En general, un solo cambio de base puede detectarse mediante dos sondas que se encuentran con la base terminal de una sonda que se empareja con la base que se está analizando. Si la base terminal se empareja con la plantilla, la ligasa puede unir las dos sondas. Si la base terminal no se empareja, la ligasa no unirá las sondas. Dado que la ligasa es termoestable, la reacción se puede ciclar y los productos de la ligadura se pueden amplificar. P: ¿Cuánta ligadura ocurre en los desajustes al usar la Taq ADN Ligasa? R: El máximo observado es 1.3 % de ligadura en los desajustes. P: ¿Cuántos ciclos de temperatura sobrevivirá la Taq ADN Ligasa? R: Al menos 30 ciclos. P: ¿Se puede usar la Taq ADN Ligasa para clonar? R: La Taq ADN Ligasa no ligará todos los tipos de extremos. Recomendamos usar la T4 ADN Ligasa (NEB# M0202) para clonar. P: ¿Cuál es el peso molecular de la Taq ADN Ligasa? R: La forma adenilada es de 77.2 kD y la forma no adenilada es de 76.9 kD. P: ¿Por qué el tampón de la Taq ADN Ligasa es marrón? R: El DTT y el NAD reaccionan y se vuelven marrones si el tampón se almacena a temperaturas superiores a -70 °C. El cambio de color marrón no afecta la actividad enzimática. P: ¿La Taq ADN Ligasa requiere NAD? R: Sí. La enzima tiene suficiente NAD unido, por lo que funcionará hasta cierto punto en tampones que no contienen NAD. P: ¿Cuál es la actividad de la Taq ADN ligasa en otros tampones NE? R: La actividad de la Taq ADN ligasa en otros tampones es la siguiente: NEBuffer™ r2.1: 10 000 unidades/ml NEBuffer™ r3.1: 8-10 000 unidades/ml Tampón rCutSmart™: 12-16 000 unidades/ml La actividad completa se alcanza utilizando el exclusivo tampón Taq ADN ligasa, suministrado con la enzima: 40 000 unidades/ml. P: ¿Cuál es la actividad de la Taq ADN ligasa a diferentes temperaturas? A: 4 °C: 2000 unidades/ml 16 °C: 8-10 000 unidades/ml 25 °C: 12 000 unidades/ml 37 °C: 20 000 unidades/ml 45 °C: 40 000 unidades/ml 55 °C: 40 000 unidades/ml 65 °C: 64 000 unidades/ml 75 °C: 10 000 unidades/ml 85 °C: 3-4000 unidades/ml 95 °C: < 500 unidades/ml P: ¿Cuál es la estabilidad de la Taq ADN ligasa a 95 °C? A: 0 min: 64.000 unidades/ml 1 min: 40-50.000 unidades/ml 5 min: 40-50.000 unidades/ml 10 min: 32.000 unidades/ml 15 min: 32.000 unidades/ml 20 min: 32.000 unidades/ml 30 min: 32.000 unidades/ml 45 min: 16.000 unidades/ml 60 min: 16.000 unidades/ml P: ¿Cuál es la estabilidad de la Taq ADN ligasa a temperatura ambiente? R: Más de una semana. P: ¿Qué es LCR y qué enzimas recomiendan? R: LCR (reacción en cadena de la ligasa) es un método similar a PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que amplifica el ADN y tiene aplicaciones diagnósticas prometedoras. LCR es un método dependiente de la ligadura que puede distinguir entre secuencias de ADN que difieren en un solo nucleótido (SNP). En la LCR se utilizan cuatro sondas: un par complementario a cada cadena de la secuencia diana, y la unión de ligadura se encuentra en el SNP que se desea discriminar. El método utiliza ADN ligasas termoestables, como la Taq ADN ligasa (NEB n.° M0208) y la 9°N™ ADN ligasa (NEB n.° M0238). Para obtener más información sobre la especificidad de las ligasas y las ligasas de alta fidelidad, visite "Especificidad del sustrato y discriminación de desajustes en las ADN ligasas". P: ¿Qué es la LDR y en qué se diferencia de la LCR? R: La LDR (reacción de detección de ligasa) es una metodología dependiente de la ligadura que, a diferencia de la LCR (reacción en cadena de la ligasa), implica solo un par de sondas complementarias a una cadena del ADN diana. El ciclado en la LDR produce una amplificación lineal del producto de la ligadura. Este método puede utilizarse para confirmar la presencia de un SNP específico en una secuencia diana amplificada mediante otro método (como la PCR). Al igual que con la LCR, el método utiliza una ligasa termoestable de alta fidelidad que puede discriminar la ligación de sondas con desajuste, como la Taq ADN Ligasa (NEB #M0208) y la 9°N™ ADN Ligasa (NEB #M0238). Para obtener más información sobre la especificidad de la ligasa y las ligasas de alta fidelidad, visite “Especificidad del sustrato y discriminación de desajustes en las ligasas de ADN”. P: ¿Cómo puedo diseñar sondas para LDR o LCR para maximizar la especificidad? R: Las sondas para LDR (Reacción de Detección de Ligasa) y LCR (Reacción en Cadena de la Ligasa) deben diseñarse de modo que todas se asocien dentro de un rango estrecho de temperatura (idealmente < 2 °C) y deben tener regiones de asocio de 15 a 30 bases de longitud. Normalmente, la temperatura de reacción óptima para obtener la máxima fidelidad será aproximadamente entre 2 °C por debajo y 2 °C por encima de la Tm para un conjunto de sondas determinado, calculada según las condiciones del tampón utilizado. Se recomienda encarecidamente el uso de la Calculadora de Temperatura de Reacción de la Ligasa Termoestable para seleccionar la temperatura de incubación. Sin embargo, la temperatura de reacción óptima para un conjunto de sondas debe determinarse empíricamente. Al utilizar la ADN ligasa HiFi Taq, el SNP a discriminar puede aparearse con la base 3' de la sonda anterior (que proporciona el 3'-hidroxilo a la unión de ligación) o con la base 5' de la sonda posterior (que proporciona el 5'-fosfato a la unión de ligación), ya que la ADN ligasa HiFi Taq muestra una mayor discriminación entre pares de bases correctos y no coincidentes a ambos lados de la unión de ligación. Consulte la información del producto para obtener un análisis detallado de la fidelidad de la ligación de no coincidencias con la ADN ligasa HiFi Taq, que ilustra su mayor fidelidad tanto en los extremos 3' como 5' de la unión de ligación, así como las proporciones específicas de discriminación de pares de bases. Para obtener más información sobre la especificidad de las ligasas y las ligasas de alta fidelidad, visite “Especificidad de sustrato y discriminación de desajustes en las ligasas de ADN”. P: ¿Las ligasas de ADN termoestables (como la ADN ligasa Taq, la ADN ligasa 9°N y la ADN ligasa HiFi Taq) ligan los extremos cohesivos? R: Si bien estas ligasas termoestables pueden unir extremos cohesivos con un solapamiento extenso, como los extremos cohesivos de 12 pb del genoma del bacteriófago Lambda, los salientes típicos de 4 pb generados por las enzimas de restricción de tipo II no son buenos sustratos y no se ligarán. No se recomienda el uso de ligasas de ADN termoestables en los procesos de clonación tradicionales.