New England Biolabs, M0210M, ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow)

El fragmento grande de ADN polimerasa I (Klenow) se derivó originalmente como un producto proteolítico de Categorías relacionadas Aplicaciones de manipulación de ADN Despuntado, Secuenciación de ADN, Polimerasas para manipulación de ADN, Especificación Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 10 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 37 °C. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ 2 Incubar a 25 °C 1X NEBuffer™ 2 50 mM NaCl 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 25 mM Tris-HCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 50 % glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 75 °C durante 20 minutos Peso molecular Teórico: 68000 daltons Exonucleasa 5' - 3' No Exonucleasa 3' - 5' Sí Desplazamiento de cadena + Unidad Condiciones del ensayo 1X NEBuffer 2, 33 μM dNTP que incluyen [3H]-dTTP y 70 μg/ml de ADN de esperma de arenque desnaturalizado. Tasa de error ~ 18x10 -6 bases Preguntas frecuentes P: ¿Qué ADN polimerasa puedo usar para hacer embotar el ADN? R: Nota: los dNTP deben agregarse a las reacciones de embotado Recomendamos principalmente la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (M0210) para hacer embotado. La actividad de embotado óptima es a temperatura ambiente (25 °C). La ADN polimerasa T4 (M0203) también se puede usar para hacer embotado, pero debe usarse a 12 °C para prevenir la formación de extremos hundidos debido a su muy fuerte actividad exonucleasa 3'-5'. Para hacer embotado a temperaturas termófilas, recomendamos la ADN polimerasa Vent (M0254) o Deep Vent (M0258). Si bien la polimerasa de alta fidelidad Q5 también se puede usar para hacer embotado a temperaturas termófilas, tiene requisitos de amortiguación muy estrictos para una actividad óptima y solo debe usarse con el tampón de reacción Q5. La nucleasa de frijol mungo (M0250) es nuestra única enzima de catálogo que puede eliminar los salientes 5'. Para la inactivación, recomendamos calentar + EDTA; haga clic aquí para ver nuestras pautas de inactivación. Más información Las ADN polimerasas se utilizan a menudo para embotar rellenando los extremos 5' que sobresalen (actividad de polimerización 5' → 3') y/o masticando (actividad de exonucleasa 3' → 5') los salientes 3'. En ausencia de dNTP, la actividad de la exonucleasa 3'-5' abrumará la actividad de la polimerasa 5'-3' para eliminar más nucleótidos de los deseados. Sin embargo, la enzima prefiere la actividad de polimerización 5'-3' en comparación con la actividad de la exonucleasa 3'-5' en presencia de dNTP. La presencia de dNTP garantiza que los nucleótidos se rellenen a través de la plantilla, lo que resulta en extremos romos. Para obtener más información, consulte nuestras otras preguntas frecuentes: ¿Qué significa la actividad exonucleasa para una ADN polimerasa? ¿Qué extremos tendrán mis productos de PCR? P: ¿Puedo usar una ADN polimerasa para rellenar los salientes 3' o eliminar los salientes 5'? R: No, las ADN polimerasas no pueden rellenar los salientes 3' porque solo pueden añadir nucleótidos en la dirección 5'-3'. Para eliminar los salientes 3', consulte nuestras preguntas frecuentes sobre despuntado. No, las ADN polimerasas no pueden eliminar los salientes 5'. La nucleasa de frijol mungo (M0250) es la única enzima del catálogo que puede eliminar los salientes 5'. P: ¿Cómo puedo inactivar por calor esta ADN polimerasa? R: Para la ADN polimerasa I (M0209), el fragmento Klenow grande (M0210), la ADN polimerasa T4 (M0203) y la ADN polimerasa T7 (M0274): Para evitar la formación de extremos retraídos (más allá del punto de despuntado deseado), precaliente un baño María o un termociclador a 75 °C. Antes de colocar la muestra a 75 °C, añada EDTA a la muestra hasta una concentración final de 10 mM (para quelar el cofactor Mg₂+) y luego incube a 75 °C durante 20 minutos. Tenga en cuenta que las temperaturas elevadas, las cantidades excesivas de enzima, la falta de suplementación con dNTP o los tiempos de reacción prolongados provocarán extremos retraídos debido a la actividad exonucleasa 3' → 5' de la enzima. Fragmento Klenow (3' → 5' exo-): Inactívelo calentando a 75 °C durante 20 minutos. EDTA no es necesario debido a la falta de actividad exonucleasa 3'-5'. P: ¿Puede usarse esta ADN polimerasa en reacciones de marcaje y llenado parcial? R: Para una cobertura completa y marcada de manera uniforme, la ADN polimerasa I (E. coli) (M0209) es la enzima preferida. A temperaturas de reacción elevadas, también puede usarse la ADN polimerasa Taq. Para la generación de dsADN corto, fragmentado (~250 pb) de alto rendimiento, se recomienda el fragmento Klenow (3'→5' exo-) (M0212). Traducción de nick Cuando se usa la traducción de nick para generar sondas, normalmente se usa la ADNasa I para cortar el ADN. La ADN polimerasa I (E. coli) elimina las bases principales en el nick con su actividad exonucleasa 5'→3' y luego rellena con bases marcadas. Nucleótidos modificados Dado que la eficiencia de incorporación de nucleótidos modificados es generalmente menor que la de sus contrapartes naturales, un reemplazo del 100% puede causar que la polimerasa se detenga. Para equilibrar el rendimiento con la eficiencia del etiquetado, generalmente recomendamos probar varias proporciones de dNTP modificado a natural. Las siguientes polimerasas no se recomiendan para el etiquetado o reacciones de llenado parcial porque su actividad de exonucleasa 3'-5' es difícil de controlar: ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (M2010) ADN polimerasa T4 (M0203) ADN polimerasa T7 (M0274) P: ¿Cuáles son las principales causas del fracaso de la reacción de embotamiento? R: Las siguientes condiciones pueden causar que la actividad de la exonucleasa abrume la actividad de la polimerasa, causando extremos hundidos en lugar de romos: No agregar nucleótidos o la concentración de nucleótidos es demasiado baja Agregar demasiada enzima Incubar durante demasiado tiempo Incubar a temperaturas superiores a la temperatura recomendada Inactivación por calor sin EDTA Preguntas frecuentes: ¿Se puede inactivar por calor esta polimerasa? Consulte el protocolo de despuntado recomendado para la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) haciendo clic aquí. Para la ADN polimerasa T4, haga clic aquí. P: ¿Se puede usar esta ADN polimerasa en otros NEBuffers para rellenar o despuntar salientes? R: PARA RELLENAR SALPICADURAS 5' La ADN polimerasa I (E. coli), el fragmento grande de Klenow, el fragmento de Klenow (exo-3'-5') y la ADN polimerasa T4 son activas en todos los NEBuffers, pero NEBuffer 2/2.1/r2.1 proporciona una actividad óptima. La ADN polimerasa T7 tiene una actividad óptima en su propio tampón, y su actividad se reduce un 50 % en los otros NEBuffers. Para comparar las composiciones de NEBuffers, haga clic aquí. Para ver la actividad de más enzimas modificadoras de ADN en el tampón rCutSmart, haga clic aquí. PARA DESBORDAR SOBRANTES NEBuffers ADN polimerasa I (E. coli) ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) ADN polimerasa T4 ADN polimerasa T7 1 YNY 50% 1.1 YNY 50% r1.1 YNY 50% 2 Óptimo Óptimo Y 50% 2.1 YYY 50% r2.1 YY Óptimo 50% 3 YYN 50% 3.1 YYN 50% r3.1 YYN 50% 4 YYY 50% CutSmart YYY 50% rCutSmart YYY 50% Tampón de ligasa de ADN T4 YY Tampón de reacción de polimerasa de ADN T7 Óptimo "Y" significa sí, esta polimerasa se puede usar en el tampón especificado. "N" significa no, esta polimerasa no se puede usar en el tampón especificado. Se indican los tampones óptimos. Klenow (3'-5' exo-) no se puede utilizar para eliminar voladizos.