New England Biolabs, M0214S, HpaII Metiltransferasa

La metiltransferasa HpaII reconoce la misma secuencia que la metiltransferasa MspI, pero modifica el residuo interno de citosina (C Categorías relacionadas Metiltransferasas para epigenética, enzimas modificadoras de bases Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para proteger 1 μg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl contra la escisión por la endonucleasa de restricción HpaII. Condiciones de reacción Suplemento de tampón rCutSmart™ 1X con 80 µM de S-adenosilmetionina (SAM) Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Ensayo de protección de control La HpaII metiltransferasa se incuba con 1 µg de ADN λ en 10 µl de tampón rCutSmart 1X, suplementado con 80 µM de S-adenosilmetionina, durante una hora a 37 °C, seguida de 15 minutos a 65 °C. El grado de protección de la HpaII metiltransferasa se determina mediante la adición de 40 µl de tampón NE 1, suplementado con 10 mM de MgCl₂ y 10 unidades de endonucleasa de restricción HpaII. La incubación a 37 °C durante 30 minutos es seguida por un análisis en geles de agarosa. Tampón de almacenamiento: 50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,1 mM de EDTA, 5 mM de TCEP, 200 µg/ml de BSA, 50 % de glicerol, pH 7,5 a 25 °C. Inactivación térmica a 65 °C. 20 minutos. Peso molecular teórico: 40397 daltons. Preguntas frecuentes : P: ¿Se suministra S-adenosilmetionina (SAM) con la metiltransferasa? R: Sí, se proporciona una solución madre a 32 mM. También se puede pedir por separado como producto NEB# B9003S. La SAM es el componente más lábil de la reacción. Si la solución madre tiene más de 9 meses, debe reemplazarse. P: ¿Qué se debe considerar si la metilación no se completa? R: La SAM es el componente más lábil de la reacción. Si la solución madre tiene más de 6 meses, debe reemplazarse. P: ¿Se puede inactivar la HpaII metiltransferasa por calor? R: Sí. Inactivar a 65 °C durante 20 minutos. P: ¿Requiere MgCl₂ la HpaII metiltransferasa? R: No. P: ¿Cuál es el peso molecular de la HpaII metiltransferasa? R: El peso molecular es 40397 Daltons. P: ¿Se puede usar ADN metilado HpaII para transformar E. coli? R: El ADN metilado HpaII es sensible a mcrA. Se debe usar una cepa de E. coli que carezca de mcrA o el ADN se degradará. P: ¿Funciona alguna metiltransferasa (metilasa) de NEB en el ARN? R: Sí, la metiltransferasa EcoGII (NEB #M0603) produce entre un 5 % y un 10 % de residuos de adenosina metilados en sustratos de ARN. Sin embargo, otras metiltransferasas no lo hacen. Nota: NEB ha probado las siguientes transferasas/metilasas (MT): metiltransferasa dam (NEB #M0222), metiltransferasa AluI (NEB #M0220), metiltransferasa BamHI (NEB #M0223), metiltransferasa M.SssI (NEB #M0226), metiltransferasa EcoRI (NEB #M0211), M.CviPI metiltransferasa (NEB #M0227), HaeIII metiltransferasa (NEB #M0224), HhaI metiltransferasa (NEB #M0217), HpaII metiltransferasa (NEB #M0214), MspI metiltransferasa (NEB #M0215) y TaqI metiltransferasa (NEB #M0219) utilizando sus tampones de reacción suministrados en dos sustratos: 1) Un ARNm transcrito in vitro que codifica la luciferasa de luciérnaga (1 µg) y 2) ARN HeLa total (250 ng). Cada sustrato se incubó con dos cantidades de enzima (1 y 5 µl) durante 1 hora a 37 °C (65 °C para Taq I MT), se limpió con una columna de centrifugación, se digirió hasta nucleósidos individuales con un cóctel de enzimas y se analizó por LC/MS para identificar residuos modificados y no modificados. Ninguna de las metilasas examinadas pudo transferir un grupo metilo a los sustratos de ARN examinados. P: ¿Puede decirme más sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en NEBuffers? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción que contienen BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) a tampones que contienen albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de cambiar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que alejarnos de los productos que contienen ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.