New England Biolabs, M0215S, MspI Metiltransferasa

Categorías relacionadas Metiltransferasas para epigenética, enzimas modificadoras de bases Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para proteger 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl contra la escisión por la endonucleasa de restricción MspI. Condiciones de reacción 1X MspI metiltransferasa tampón de reacción suplementado con 80 µM de S-adenosilmetionina (SAM) Incubar a 37 °C 1X MspI metilasa tampón 50 mM Tris-HCl 100 mM NaCl 5 mM β-ME 10 mM EDTA (pH 7,5 a 25 °C) Ensayo de protección de control La MspI metiltransferasa se incuba con 1 µg de ADN λ en 10 μl 1X MspI metiltransferasa tampón de reacción suplementado con 80 µM de S-adenosilmetionina, durante una hora a 37 °C seguida de 15 minutos a 65 °C. El grado de protección por MspI metiltransferasa se determina mediante la adición de 40 μl de NEBuffer 2 suplementado con 10 mM MgCl2 y 5 unidades de endonucleasa de restricción MspI. La incubación para MspI a 37 °C es seguida por el análisis en geles de agarosa. Tampón de almacenamiento 50 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 5 mM β-ME 10 mM EDTA 200 µg/ml BSA 50% Glicerol pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor No Peso molecular Teórico: 40397 daltons Preguntas frecuentes P: ¿Se suministra S-adenosilmetionina (SAM) con la metiltransferasa? R: Sí, se proporciona una solución madre a 32 mM. También se puede pedir por separado como producto NEB# B9003S. El SAM es el componente más lábil de la reacción. Si la solución madre tiene más de 9 meses, debe reemplazarse. P: ¿Qué se debe considerar si la metilación no se completa? R: El SAM es el componente más lábil de la reacción. Si la solución madre tiene más de 6 meses, debe reemplazarse. P: ¿Cuál es el peso molecular de la MspI metiltransferasa? R: El peso molecular es de 47,654 daltons. P: ¿Funciona alguna metiltransferasa NEB (metilasa) en el ARN? R: Sí, la EcoGII metiltransferasa (NEB #M0603) produce entre un 5% y un 10% de residuos de adenosina metilados en sustratos de ARN. Sin embargo, otras metiltransferasas no lo hacen. Tenga en cuenta: NEB ha probado las siguientes transferasas/metilasas (MT): dam metiltransferasa (NEB #M0222), AluI metiltransferasa (NEB #M0220), BamHI metiltransferasa (NEB #M0223), M.SssI metiltransferasa (NEB #M0226), EcoRI metiltransferasa (NEB #M0211), M.CviPI metiltransferasa (NEB #M0227), HaeIII metiltransferasa (NEB #M0224), HhaI metiltransferasa (NEB #M0217), HpaII metiltransferasa (NEB #M0214), MspI metiltransferasa (NEB #M0215) y TaqI metiltransferasa (NEB #M0219) utilizando sus tampones de reacción suministrados en dos sustratos: 1) Un ARNm transcrito in vitro que codifica la luciferasa de luciérnaga (1 µg) y 2) ARN HeLa total (250 ng). Cada sustrato se incubó con dos cantidades de enzima (1 y 5 µl) durante 1 hora a 37 °C (65 °C para Taq I MT), se purificó mediante una columna de centrifugación, se digirió a nucleósidos individuales mediante un cóctel de enzimas y se analizó por LC/MS para identificar residuos modificados y no modificados. Ninguna de las metilasas examinadas logró transferir un grupo metilo a los sustratos de ARN examinados.