New England Biolabs, M0217S, Hhal Metiltransferasa

La HhaI metiltransferasa modifica el residuo interno de citosina (C Categorías relacionadas Metiltransferasas para epigenética, enzimas modificadoras de bases Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para proteger 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl contra la escisión por la endonucleasa de restricción HhaI. Condiciones de reacción Suplemento de tampón rCutSmart™ 1X con 80 µM de S-adenosilmetionina (SAM) Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Ensayo de protección de control La HhaI metiltransferasa se incuba con 1 µg de ADN λ en 10 μl de tampón rCutSmart 1X, suplementado con 80 µM de S-adenosilmetionina, durante una hora a 37 °C, seguida de 15 minutos a 65 °C. El grado de protección de la metiltransferasa HhaI se determina añadiendo 40 μl de tampón rCutSmart suplementado con 100 µg/ml de BSA, 10 mM de MgCl₂ y 10 unidades de la endonucleasa de restricción HhaI. Tras la incubación a 37 °C durante 30 minutos, se realiza un análisis en gel de agarosa. Tampón de almacenamiento : 50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 5 mM de TCEP, 0,1 mM de EDTA, 200 µg/ml de BSA, pH 7,5 a 25 °C. Inactivación térmica: No. Peso molecular teórico: 36994. Preguntas frecuentes sobre daltons P: ¿Se suministra S-adenosilmetionina (SAM) con la metiltransferasa? R: Sí, se proporciona una solución madre a 32 mM. También se puede pedir por separado como producto NEB n.° B9003S. La SAM es el componente más lábil de la reacción. Si la solución madre tiene más de 9 meses, debe reemplazarse. P: ¿Qué se debe tener en cuenta si la metilación no se completa? R: La SAM es el componente más lábil de la reacción. Si la solución madre tiene más de 6 meses, debe reemplazarse. P: ¿Cuál es el peso molecular de la metiltransferasa HhaI? R: El peso molecular es de 36.994 daltons. P: ¿Funcionará alguna metiltransferasa NEB (metilasa) en el ARN? R: Sí, la metiltransferasa EcoGII (NEB n.° M0603) produce entre un 5 % y un 10 % de residuos de adenosina metilados en sustratos de ARN. Sin embargo, otras Las metiltransferasas no lo hacen. Nota: NEB ha probado las siguientes transferasas/metilasas (MT): dam metiltransferasa (NEB #M0222), AluI metiltransferasa (NEB #M0220), BamHI metiltransferasa (NEB #M0223), M.SssI metiltransferasa (NEB #M0226), EcoRI metiltransferasa (NEB #M0211), M.CviPI metiltransferasa (NEB #M0227), HaeIII metiltransferasa (NEB #M0224), HhaI metiltransferasa (NEB #M0217), HpaII metiltransferasa (NEB #M0214), MspI metiltransferasa (NEB #M0215) y TaqI metiltransferasa (NEB #M0219) utilizando los tampones de reacción suministrados en dos sustratos: 1) Un análisis in vitro ARNm transcrito que codifica la luciferasa de luciérnaga (1 µg) y 2) ARN HeLa total (250 ng). Cada sustrato se incubó con dos cantidades de enzima (1 y 5 µl) durante 1 hora a 37 °C (65 °C para Taq I MT), se purificó mediante una columna de centrifugación, se digirió a nucleósidos individuales mediante una mezcla de enzimas y se analizó por LC/MS para identificar residuos modificados y no modificados. Ninguna de las metilasas examinadas logró transferir un grupo metilo a los sustratos de ARN examinados. P: ¿Podría explicarme más sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NE? A: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.