New England Biolabs, M0219S, TaqI Metiltransferasa

Categorías relacionadas Metiltransferasas para epigenética, enzimas modificadoras de bases Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para proteger 1 μg de ADN λ en 1 hora a 65 °C en un volumen de reacción total de 20 μl contra la escisión por la endonucleasa de restricción Taq I. Condiciones de reacción Suplemento de tampón rCutSmart™ 1X con 80 µM de S-adenosilmetionina (SAM) Incubar a 65 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Ensayo de protección de control Condiciones del ensayo de protección: La Taq I metiltransferasa se incuba con 1 µg de ADN λ en 20 μl de tampón rCutSmart 1X y 80 µM de S-adenosilmetionina durante 1 hora a 65 °C. El grado de protección de la Taq I metiltransferasa se determina añadiendo 30 μl de tampón rCutSmart 1X y 10 unidades de endonucleasa de restricción Taq I. Tras 15 minutos de incubación a 65 °C, se realiza un análisis en gel de agarosa. Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 100 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM BSA 200 µg/ml Glicerol al 50 % pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor No Peso molecular teórico: 47845 daltons Preguntas frecuentes P: ¿Se suministra S-adenosilmetionina (SAM) con la metiltransferasa? R: Sí, se proporciona una solución madre de 32 mM. También se puede pedir por separado como producto NEB n.º B9003S. La SAM es el componente más lábil de la reacción. Si la solución madre tiene más de 9 meses, debe reemplazarse. P: ¿Qué se debe tener en cuenta si la metilación no se completa? R: El SAM es el componente más lábil de la reacción. Si la solución madre tiene más de 6 meses, debe reemplazarse. P: ¿Cuál es la actividad de la TaqI metiltransferasa a 37 °C? R: La TaqI metiltransferasa proporciona una actividad del 25 % a 37 °C. P: ¿Cuál es la actividad de la TaqI metiltransferasa a 50 °C? R: La actividad es cercana al 100 %. La enzima se puede usar en ADN embebido en agarosa de bajo punto de fusión a esta temperatura. El tapón no se derretirá. P: ¿La TaqI metiltransferasa requiere MgCl2? R: No. P: ¿La TaqI metiltransferasa requiere BSA? R: Sí, la BSA o la albúmina recombinante (rAlbúmina) aumentan la actividad de la TaqI metiltransferasa en 4 veces. P: ¿Cuál es la actividad de la TaqI metiltransferasa en otros tampones? R: La actividad de la TaqI metiltransferasa es de aproximadamente el 50 % en el tampón NEBuffer 3. P: ¿Cuál es el peso molecular de la TaqI metiltransferasa? R: El peso molecular es de 47 845 daltons. P: ¿Se utiliza la TaqI metiltransferasa en alguna técnica especial? R: Sí. La TaqI metiltransferasa (TCGA*) puede utilizarse para crear el sitio de reconocimiento de 8 bases TCGA*TCGA, que puede escindirse con DpnI. DpnI reconoce GATC y escinde el ADN cuando está metilado. No sobredigiera el ADN, ya que DpnI cortará lentamente el ADN hemimetilado (TCGATC). P: ¿Funcionarán las metiltransferasas NEB (metilasas) en el ARN? R: Sí, la metiltransferasa EcoGII (NEB #M0603) produce entre un 5 % y un 10 % de residuos de adenosina metilados en sustratos de ARN. Sin embargo, otras metiltransferasas no lo hacen. Tenga en cuenta: NEB ha probado las siguientes transferasas/metilasas (MT): dam metiltransferasa (NEB #M0222), AluI metiltransferasa (NEB #M0220), BamHI metiltransferasa (NEB #M0223), M.SssI metiltransferasa (NEB #M0226), EcoRI metiltransferasa (NEB #M0211), M.CviPI metiltransferasa (NEB #M0227), HaeIII metiltransferasa (NEB #M0224), HhaI metiltransferasa (NEB #M0217), HpaII metiltransferasa (NEB #M0214), MspI metiltransferasa (NEB #M0215) y TaqI metiltransferasa (NEB #M0219) utilizando sus tampones de reacción suministrados en dos sustratos: 1) Un ARNm transcrito in vitro que codifica luciferasa de luciérnaga (1 µg) y 2) ARN HeLa total (250 ng). Cada sustrato se incubó con dos cantidades de enzima (1 y 5 µl) durante 1 hora a 37 °C (65 °C para Taq I MT), se purificó mediante una columna de centrifugación, se digirió a nucleósidos individuales mediante una mezcla de enzimas y se analizó por LC/MS para identificar residuos modificados y no modificados. Ninguna de las metilasas examinadas logró transferir un grupo metilo a los sustratos de ARN examinados. P: ¿Podría explicarme más sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NE? A: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.