New England Biolabs, M0220S, AluI Metiltransferasa

Categorías relacionadas Metiltransferasas para epigenética, enzimas modificadoras de bases Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para proteger 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl contra la escisión por la endonucleasa de restricción AluI. Condiciones de reacción Tampón de reacción de metiltransferasa AluI 1X suplementado con 80 µM de S-adenosilmetionina (SAM) Incubar a 37 °C Ensayo de protección de control La metiltransferasa AluI se incuba con 1 µg de ADN λ en 10 μl de tampón de metiltransferasa AluI 1X, suplementado con 80 µM de S-adenosilmetionina, durante una hora a 37 °C seguida de 15 minutos a 65 °C. El grado de protección de la AluI metiltransferasa se determina añadiendo 40 μl de NEBuffer 1 suplementado con 10 mM de MgCl₂ y 10 unidades de la endonucleasa de restricción AluI. Tras una incubación a 37 °C durante 30 minutos, se realiza un análisis en un gel de agarosa. Tampón de almacenamiento: Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM, DTT 1 mM, EDTA 0,1 mM, BSA 200 µg/ml, glicerol al 50 %, pH 7,5 a 25 °C. Inactivación térmica: 65 °C durante 20 minutos. Preguntas frecuentes : P: ¿Se suministra S-adenosilmetionina (SAM) con la metiltransferasa? R: Sí, se proporciona una solución madre a 32 mM. También se puede pedir por separado como producto NEB n.º B9003S. La SAM es el componente más lábil de la reacción. Si la solución madre tiene más de 9 meses, debe reemplazarse. P: ¿Qué se debe tener en cuenta si la metilación no se completa? R: El SAM es el componente más lábil de la reacción. Si la solución madre tiene más de 6 meses, debe reemplazarse. P: ¿Se puede inactivar la AluI metiltransferasa por calor? R: Sí. Inactivar a 65 °C durante 20 minutos. P: ¿La AluI metiltransferasa requiere MgCl2? R: No. P: ¿Cuál es el peso molecular de la AluI metiltransferasa? R: El peso molecular es de 61.493 daltons. P: ¿Se puede utilizar ADN metilado de AluI para transformar E. coli? R: El ADN metilado de AluI es sensible a mcrB. Se debe utilizar una cepa de E. coli que carezca de mcrB o el ADN se degradará. P: ¿La metilación con AluI metiltransferasa bloquea la endonucleasa de restricción SacI? R: Sí. P: ¿Funciona alguna metiltransferasa NEB (metilasa) en el ARN? R: Sí, la metiltransferasa EcoGII (NEB #M0603) produce entre un 5 % y un 10 % de residuos de adenosina metilados en sustratos de ARN. Sin embargo, otras metiltransferasas no lo hacen. Tenga en cuenta: NEB ha probado las siguientes transferasas/metilasas (MT): dam metiltransferasa (NEB #M0222), AluI metiltransferasa (NEB #M0220), BamHI metiltransferasa (NEB #M0223), M.SssI metiltransferasa (NEB #M0226), EcoRI metiltransferasa (NEB #M0211), M.CviPI metiltransferasa (NEB #M0227), HaeIII metiltransferasa (NEB #M0224), HhaI metiltransferasa (NEB #M0217), HpaII metiltransferasa (NEB #M0214), MspI metiltransferasa (NEB #M0215) y TaqI metiltransferasa (NEB #M0219) utilizando sus tampones de reacción suministrados en dos sustratos: 1) Un ARNm transcrito in vitro que codifica la luciferasa de luciérnaga (1 µg) y 2) ARN HeLa total (250 ng). Cada sustrato se incubó con dos cantidades de enzima (1 y 5 µl) durante 1 hora a 37 °C (65 °C para Taq I MT), se purificó mediante una columna de centrifugación, se digirió a nucleósidos individuales mediante un cóctel de enzimas y se analizó por LC/MS para identificar residuos modificados y no modificados. Ninguna de las metilasas examinadas logró transferir un grupo metilo a los sustratos de ARN examinados.