New England Biolabs, M0222S, presa de metiltransferasa

Categorías relacionadas Metiltransferasas para epigenética Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para proteger 1 µg ( dam -) de ADN lambda en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl contra la escisión por la endonucleasa de restricción MboI. Condiciones de reacción 1X dam metiltransferasa tampón de reacción suplementado con 80 µM de S-adenosilmetionina (SAM) Incubar a 37 °C 1X dam metiltransferasa tampón 50 mM Tris-HCl 5 mM β-ME 10 mM EDTA (pH 7,5 a 25 °C) Ensayo de protección de control La dam metiltransferasa se incuba con 1 µg de ADN ( dam- ) Lambda en 10 μl de 1X dam metiltransferasa tampón, suplementado con 80 µM de S-adenosilmetionina, durante 1 hora a 37 °C seguido de 15 minutos a 65 °C. El grado de protección se determina mediante la adición de 40 μl de 1X NEBuffer 3 suplementado con 10 mM de MgCl2 y 10 unidades de endonucleasa de restricción MboI. La incubación a 37 °C durante 1 hora es seguida por el análisis en un gel de agarosa. Tampón de almacenamiento 50 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1 mM DTT 10 mM EDTA 200 µg/ml BSA 50% Glicerol pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Se suministra S-adenosilmetionina (SAM) con la metiltransferasa? R: Sí, se proporciona una solución madre a 32 mM. También se puede pedir por separado como producto NEB# B9003S. El SAM es el componente más lábil de la reacción. Si la solución madre tiene más de 9 meses, debe reemplazarse. P: ¿Qué se debe tener en cuenta si la metilación no se completa? R: El SAM es el componente más lábil de la reacción. Si la solución madre tiene más de 6 meses, debe reemplazarse. P: ¿Se puede inactivar la dam metiltransferasa por calor? R: Sí. Inactivar a 65 °C durante 20 minutos. P: ¿Requiere la dam metiltransferasa MgCl2? R: No. P: ¿Es la dam metiltransferasa sensible a la sal? R: Sí. Asegúrese de que la solución de ADN tenga una baja concentración de sal o que represente solo un pequeño porcentaje del volumen final de la reacción. Si la sal es un problema, reduzca la concentración de sal mediante diálisis por gotas. P: ¿Escindirá la DpnI el ADN metilado de la dam? R: Sí. P: ¿Funcionará alguna metiltransferasa NEB (metilasa) en el ARN? R: Sí, la EcoGII metiltransferasa (NEB n.º M0603) produce entre un 5 % y un 10 % de residuos de adenosina metilados en sustratos de ARN. Sin embargo, otras metiltransferasas no lo hacen. Tenga en cuenta: NEB ha probado las siguientes transferasas/metilasas (MT): dam metiltransferasa (NEB #M0222), AluI metiltransferasa (NEB #M0220), BamHI metiltransferasa (NEB #M0223), M.SssI metiltransferasa (NEB #M0226), EcoRI metiltransferasa (NEB #M0211), M.CviPI metiltransferasa (NEB #M0227), HaeIII metiltransferasa (NEB #M0224), HhaI metiltransferasa (NEB #M0217), HpaII metiltransferasa (NEB #M0214), MspI metiltransferasa (NEB #M0215) y TaqI metiltransferasa (NEB #M0219) utilizando sus tampones de reacción suministrados en dos sustratos: 1) Un ARNm transcrito in vitro que codifica la luciferasa de luciérnaga (1 µg) y 2) ARN HeLa total (250 ng). Cada sustrato se incubó con dos cantidades de enzima (1 y 5 µl) durante 1 hora a 37 °C (65 °C para Taq I MT), se purificó mediante una columna de centrifugación, se digirió a nucleósidos individuales mediante un cóctel de enzimas y se analizó por LC/MS para identificar residuos modificados y no modificados. Ninguna de las metilasas examinadas logró transferir un grupo metilo a los sustratos de ARN examinados.