New England Biolabs, M0226S, CpG Metiltransferasa (M.SssI)

Categorías relacionadas Enzimas de restricción sensibles a la metilación y dependientes de la metilación para la epigenética, Metiltransferasas para la epigenética, Enzimas modificadoras de bases Definición de unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para proteger 1 μg de ADN λ en un volumen de reacción total de 20 μl en 1 hora a 37 °C contra la escisión por la endonucleasa de restricción BstUI. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ 2 suplementado con 160 µM de S-adenosilmetionina (SAM) Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ 2 50 mM de NaCl 10 mM de Tris-HCl 10 mM de MgCl2 1 mM de DTT (pH 7,9 a 25 °C) Ensayo de protección de control Una reacción de 20 μl en NEBuffer 2 que contiene 1 μg de ADN Lambda, suplementado con 160 uM de SAM y 1 unidad de M.Sss I incubado durante 1 hora a 37 °C, seguido de inactivación térmica a 65 °C durante 15 minutos, da como resultado una protección del 95 % contra la digestión con 10 unidades de BstU I en tampón rCutSmart incubado a 60 °C durante 30 minutos, como se determinó mediante electroforesis en gel de agarosa. Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM DTT EDTA 0,1 mM Glicerol al 50 % BSA 200 µg/ml pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Se suministra S-adenosilmetionina (SAM) con la metiltransferasa? R: Sí, se proporciona una solución madre a 32 mM. También se puede pedir por separado como producto NEB n.º B9003S. La SAM es el componente más lábil de la reacción. Si la solución madre tiene más de 9 meses, debe reemplazarse. P: ¿Qué se debe tener en cuenta si la metilación con SssI metiltransferasa no se completa? R: La SAM es el componente más lábil de la reacción. Si la solución madre tiene más de 6 meses, debe reemplazarse. Si se metila más de 1 μg de ADN, aumente la concentración de SAM de los 160 μM recomendados a 640 μM. Se puede metilar un máximo de 4 μg por 20 μl de reacción utilizando 640 μM de SAM. Utilice de 2 a 4 unidades por microgramo. Utilice SssI M0226M concentrado para mantener baja la concentración de glicerol. Aumente el tiempo de reacción a 4 horas. Debido a la inestabilidad de SAM y al hecho de que el subproducto de la reacción (S-adenosilhomocisteína) es un inhibidor, no se recomiendan las reacciones durante la noche. Limpie el ADN. Retire los cebadores de PCR y otros ADN pequeños utilizando una columna de centrifugación o un procedimiento similar. Dialice la muestra por gotas para eliminar las sales. P: ¿Cuál es la actividad de la SssI metiltransferasa en otros NEBuffers, incluido rCutSmart? R: La actividad es del 25 % en NEBuffer 3 y del 10 % en NEBuffer 1 y 4. También se puede usar en rCutsmart Buffer. Para ver su % de actividad funcional en rCutsmart y la de otras enzimas modificadoras de ADN en el flujo de trabajo de clonación, consulte la tabla "Actividad de enzimas modificadoras de ADN en rCutSmart® Buffer". P: ¿Puede la SssI metiltransferasa metilar ADN monocatenario? R: No. P: ¿Se puede usar la SssI metiltransferasa para generar un control positivo para PCR específica de metilación o secuenciación con bisulfato? R: Sí, se puede usar SssI para generar un control positivo para el procedimiento. Sugerimos 4 unidades por μg de ADN durante 2 horas. El bisulfato se usa para convertir C no metilado en T, dejando C metilado como C en el ADN sustrato. Se usa una muestra de sustrato modificado y no modificado en una reacción de PCR. Las diferencias observadas en los productos de PCR de secuenciación indican regiones metiladas versus no metiladas (1). (1) Frommer, M. et al, Proc. Natl. Sci. USA (1992) Vol. 89, pp1827-1831. P: ¿Cuál es la actividad específica de la SssI metiltransferasa? R: La actividad específica es de aproximadamente 41.000 unidades/mg. P: ¿La SssI metiltransferasa requiere magnesio en el tampón? R: No. Con magnesio, la reacción enzimática es distributiva y la enzima exhibe actividad topoisomerasa. Sin magnesio, la reacción es procesiva (2). (2) Matsuo et al, Nucl. Acids Res. (1994) Vol 22, 5354-5359. P: ¿Se puede radiomarcar el ADN con la SssI metiltransferasa? R: Sí. Haga clic para obtener un protocolo completo. P: ¿Se puede usar ADN metilado con SssI para transformar E. coli? R: El ADN metilado con SssI es sensible a mcr. Se debe usar una cepa de E. coli que carezca de mcrA, mcrBC y Mrr; de lo contrario, el ADN se degradará. P: ¿Cuál es el peso molecular de la SssI (CpG) metiltransferasa? R: El peso molecular es de 42.000 daltons. P: ¿Funciona alguna metiltransferasa NEB (metilasa) en el ARN? R: Sí, la EcoGII metiltransferasa (NEB #M0603) produce entre un 5 % y un 10 % de residuos de adenosina metilados en sustratos de ARN. Sin embargo, otras metiltransferasas no lo hacen. Tenga en cuenta: NEB ha probado las siguientes transferasas/metilasas (MT): dam metiltransferasa (NEB #M0222), AluI metiltransferasa (NEB #M0220), BamHI metiltransferasa (NEB #M0223), M.SssI metiltransferasa (NEB #M0226), EcoRI metiltransferasa (NEB #M0211), M.CviPI metiltransferasa (NEB #M0227), HaeIII metiltransferasa (NEB #M0224), HhaI metiltransferasa (NEB #M0217), HpaII metiltransferasa (NEB #M0214), MspI metiltransferasa (NEB #M0215) y TaqI metiltransferasa (NEB #M0219) utilizando sus tampones de reacción suministrados en dos sustratos: 1) Un ARNm transcrito in vitro que codifica la luciferasa de luciérnaga (1 µg) y 2) ARN HeLa total (250 ng). Cada sustrato se incubó con dos cantidades de enzima (1 y 5 µl) durante 1 hora a 37 °C (65 °C para Taq I MT), se purificó mediante una columna de centrifugación, se digirió a nucleósidos individuales mediante un cóctel de enzimas y se analizó por LC/MS para identificar residuos modificados y no modificados. Ninguna de las metilasas examinadas logró transferir un grupo metilo a los sustratos de ARN examinados.