New England Biolabs, M0227L, GpC metiltransferasa (M.CviPI)

Categorías relacionadas Metiltransferasas para epigenética, Análisis de cromatina, Enzimas modificadoras de bases Definición de unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para proteger 1 µg de ADN λ en un volumen de reacción total de 20 μl en 1 hora a 37 °C contra la escisión por la endonucleasa de restricción HaeIII. Condiciones de reacción Suplemento del tampón de reacción GC 1X con 160 µM de S-adenosilmetionina (SAM) Incubar a 37 °C Tampón de reacción GC 1X NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM DTT (pH 8,5 a 25 °C) Ensayo de protección de control M.CviPI se incuba con 1 µg de ADN λ en 20 μl de tampón de reacción GC 1X y 160 µM de S-adenosilmetionina, durante una hora a 37 °C. El grado de protección por M.CviPI se determina mediante la adición de 30 μl de tampón NE 2 que contiene 10 unidades de endonucleasa de restricción HaeIII. La incubación durante 1 hora a 37 °C es seguida por el análisis en un gel de agarosa. Tampón de almacenamiento : Tris-HCl 15 mM, NaCl 0,2 M, DTT 1 mM, EDTA 0,1 mM, BSA 200 µg/ml, glicerol al 50 %, pH 7,4 a 25 °C , inactivación térmica a 65 °C durante 20 minutos. Preguntas frecuentes : P: ¿Funcionará la GpC metiltransferasa (M. CviPI) en el tampón rCutSmart? R: La GpC metiltransferasa (M. CviPI) funcionará en el tampón rCutSmart, con la adición de DTT. Para ver su porcentaje de actividad funcional en rCutSmart y la de otras enzimas modificadoras de ADN en el flujo de trabajo de clonación, consulte la tabla de actividad de las enzimas modificadoras de ADN en el tampón rCutSmart®. P: ¿Funcionarán las metiltransferasas NEB (metilasas) en el ARN? R: Sí, la metiltransferasa EcoGII (NEB #M0603) produce entre un 5 % y un 10 % de residuos de adenosina metilados en sustratos de ARN. Sin embargo, otras metiltransferasas no lo hacen. Tenga en cuenta: NEB ha probado las siguientes transferasas/metilasas (MT): dam metiltransferasa (NEB #M0222), AluI metiltransferasa (NEB #M0220), BamHI metiltransferasa (NEB #M0223), M.SssI metiltransferasa (NEB #M0226), EcoRI metiltransferasa (NEB #M0211), M.CviPI metiltransferasa (NEB #M0227), HaeIII metiltransferasa (NEB #M0224), HhaI metiltransferasa (NEB #M0217), HpaII metiltransferasa (NEB #M0214), MspI metiltransferasa (NEB #M0215) y TaqI metiltransferasa (NEB #M0219) utilizando sus tampones de reacción suministrados en dos sustratos: 1) Un ARNm transcrito in vitro que codifica la luciferasa de luciérnaga (1 µg) y 2) ARN HeLa total (250 ng). Cada sustrato se incubó con dos cantidades de enzima (1 y 5 µl) durante 1 hora a 37 °C (65 °C para Taq I MT), se purificó mediante una columna de centrifugación, se digirió a nucleósidos individuales mediante un cóctel de enzimas y se analizó por LC/MS para identificar residuos modificados y no modificados. Ninguna de las metilasas examinadas logró transferir un grupo metilo a los sustratos de ARN examinados.