New England Biolabs, M0238S, 9°N™ ADN ligasa

La ADN ligasa 9°N se ha reformulado con albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.º 10230152. Categorías relacionadas Aplicaciones de las ADN ligasas Clonación Especificación de la ligadura Definición de la unidad (unidad de extremo cohesivo) Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para obtener una ligadura del 50 % de los extremos cohesivos de 12 pares de bases de 1 µg de ADN λ digerido con BstEII en un volumen de reacción total de 50 μl en 15 minutos a 45 °C. Una unidad de extremo cohesivo equivale a la unidad de cierre de mella (1). Condiciones de reacción 1 tampón de reacción de ADN ligasa 9°N 1X Incubar a 45 °C 1 tampón de reacción de ADN ligasa 9°N 10 mM Tris-HCl 600 µM ATP 2,5 mM DTT 2,5 mM MgCl2 0,1 % Triton® X-100 (pH 7,5 a 25 °C) Concentración de uso 40 000 unidades/ml Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol 10 mM sulfato de amonio pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor Sin unidad Condiciones del ensayo 1 tampón de reacción de ADN ligasa 9°N y 20 µg/ml de λ digerido con BstEII ADN en una reacción de 50 μl. Después de la incubación a 45 °C durante 15 minutos, la reacción se termina mediante la adición de colorante de parada (glicerol al 50 %, EDTA 50 mM y azul de bromofenol), se calienta a 70 °C durante 10 minutos y luego se carga en un gel de agarosa al 0,7 %. Debido a la presencia de ligasa, los extremos cos del ADN λ digerido con BstEII permanecerán juntos después del tratamiento térmico a 70 °C. Preguntas frecuentes P: ¿Qué es LCR y qué enzimas recomiendan? R: LCR (reacción en cadena de la ligasa) es un método similar a PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que amplifica el ADN y tiene aplicaciones diagnósticas prometedoras. LCR es un método dependiente de la ligadura que puede distinguir entre secuencias de ADN que difieren en un solo nucleótido (SNP). Se utilizan cuatro sondas en LCR, un par complementario a cada cadena en la secuencia diana, con la unión de ligadura en el SNP que se va a discriminar. El método utiliza ligasas de ADN termoestables como la Taq ADN Ligasa (NEB #M0208) y la 9°N™ ADN Ligasa (NEB #M0238). Para más información sobre la especificidad de las ligasas y las ligasas de alta fidelidad, visite “Especificidad del sustrato y discriminación de desajustes en las ligasas de ADN”. P: ¿Qué es la LDR y en qué se diferencia de la LCR? R: La LDR (Reacción de Detección de Ligasa) es una metodología dependiente de la ligación que, a diferencia de la LCR (Reacción en Cadena de la Ligasa), implica solo un par de sondas complementarias a una hebra del ADN diana. El ciclado en la LDR produce una amplificación lineal del producto de la ligación. Este método puede utilizarse para confirmar la presencia de un SNP específico en una secuencia diana amplificada mediante otro método (como la PCR). Al igual que con la LCR, el método utiliza una ligasa termoestable de alta fidelidad que puede discriminar la ligación de sondas con desajuste, como la Taq ADN Ligasa (NEB #M0208) y la 9°N™ ADN Ligasa (NEB #M0238). Para obtener más información sobre la especificidad de la ligasa y las ligasas de alta fidelidad, visite “Especificidad del sustrato y discriminación de desajustes en las ligasas de ADN”. P: ¿Cómo puedo diseñar sondas para LDR o LCR para maximizar la especificidad? R: Las sondas para LDR (Reacción de Detección de Ligasa) y LCR (Reacción en Cadena de la Ligasa) deben diseñarse de modo que todas se asocien dentro de un rango estrecho de temperatura (idealmente < 2 °C) y deben tener regiones de asocio de 15 a 30 bases de longitud. Normalmente, la temperatura de reacción óptima para obtener la máxima fidelidad será aproximadamente entre 2 °C por debajo y 2 °C por encima de la Tm para un conjunto de sondas determinado, calculada según las condiciones del tampón utilizado. Se recomienda encarecidamente el uso de la Calculadora de Temperatura de Reacción de la Ligasa Termoestable para seleccionar la temperatura de incubación. Sin embargo, la temperatura de reacción óptima para un conjunto de sondas debe determinarse empíricamente. Al utilizar la ADN ligasa HiFi Taq, el SNP a discriminar puede aparearse con la base 3' de la sonda anterior (que proporciona el 3'-hidroxilo a la unión de ligación) o con la base 5' de la sonda posterior (que proporciona el 5'-fosfato a la unión de ligación), ya que la ADN ligasa HiFi Taq muestra una mayor discriminación entre pares de bases correctos y no coincidentes a ambos lados de la unión de ligación. Consulte la información del producto para obtener un análisis detallado de la fidelidad de la ligación de no coincidencias con la ADN ligasa HiFi Taq, que ilustra su mayor fidelidad tanto en los extremos 3' como 5' de la unión de ligación, así como las proporciones específicas de discriminación de pares de bases. Para obtener más información sobre la especificidad de las ligasas y las ligasas de alta fidelidad, visite “Especificidad de sustrato y discriminación de desajustes en las ligasas de ADN”. P: ¿Las ligasas de ADN termoestables (como la ADN ligasa Taq, la ADN ligasa 9°N y la ADN ligasa HiFi Taq) ligan los extremos cohesivos? R: Si bien estas ligasas termoestables pueden unir extremos cohesivos con un solapamiento extenso, como los extremos cohesivos de 12 pb del genoma del bacteriófago Lambda, los salientes típicos de 4 pb generados por las enzimas de restricción de tipo II no son buenos sustratos y no se ligarán. No se recomienda el uso de ligasas de ADN termoestables en los procesos de clonación tradicionales.