New England Biolabs, M0250S, Nucleasa de frijol mungo

Categorías relacionadas Exonucleasas y endonucleasas no específicas, Aplicaciones de modificación de ARN Especificación de embotamiento Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN monocatenario M13mp18 en fragmentos de menos de 1 kb de longitud en un volumen de reacción total de 80 μl en tampón de reacción de nucleasa de frijol mungo 1X cuando se incuba durante 15 minutos a 37 °C. Condiciones de reacción Tampón de reacción de nucleasa de frijol mungo 1X Incubar a 30 °C Tampón de reacción de nucleasa de frijol mungo 1X NaCl 30 mM acetato de sodio 50 mM ZnSO4 1 mM (pH 5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Acetato de sodio 10 mM Acetato de zinc 0,1 mM Cisteína 1 mM 50 % Glicerol Triton® X-100 al 0,001 % pH 5 a 25 °C Peso molecular Teórico: 39 kDa Preguntas frecuentes P: ¿Debo usar nucleasa de frijol mungo o ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB n.º M0210)? R: Se debe usar nucleasa de frijol mungo si el objetivo es masticar una extensión de 5'. La ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) llenará una extensión de 5' y masticará una extensión de 3'. La nucleasa de frijol mungo se puede usar para reducir una extensión 3', pero la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) puede ser una opción ligeramente mejor debido a su capacidad para actuar en las muescas y degradar los extremos a medida que "respiran". Nota: Un saliente 3' no se puede rellenar. P: ¿Es activa la nucleasa de frijol mungo en otros tampones NE? R: La nucleasa de frijol mungo también es completamente activa en el tampón rCutSmart®. La enzima también se puede usar en los tampones NE 1, 2, 4, r1.1 y r2.1; sin embargo, el tiempo de reacción debe duplicarse a 1 hora a 30 °C cuando se usan estos tampones. La actividad es baja en los tampones NE 3 y r3.1. P: ¿Se puede inactivar la nucleasa de frijol mungo mediante calor? R: ¡NO INTENTE INACTIVARLA POR CALOR! Aunque la nucleasa de frijol mungo puede inactivarse mediante calor, no se recomienda, ya que el ADN comienza a "respirar" antes de que se inactive, lo que provoca una degradación indeseable en las secciones de respiración. Purifique el ADN mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol o purificación en columna de centrifugación. P: ¿Es necesario añadir Zn₂₄ a una reacción de nucleasa de frijol mungo? R: Ya no es necesario complementar las reacciones de nucleasa de frijol mungo con Zn₂₄. El acetato de zinc del tampón de almacenamiento satisface el requerimiento de Zn₂₄ de la enzima incluso después de la dilución en una reacción. P: ¿La nucleasa de frijol mungo degrada el ADN bicatenario? R: Cuando se utiliza a temperaturas superiores a los 30 °C recomendados, o durante períodos prolongados, se producirá la degradación del ADN sustrato. Además, dado que se sabe que la actividad endonucleica ocurre en "burbujas" en la hélice de ADN, que se forman transitoriamente a lo largo de la molécula, los sustratos que ya están mellados o que tienen un alto contenido de AT son más susceptibles a esta actividad endonucleica.