New England Biolabs, M0251L, ARN polimerasa T7

Categorías relacionadas Síntesis de ARN Transcripción in vitro (IVT), Soluciones de nucleótidos para aplicaciones de ARN Amplificación mediada por transcripción y NASBA Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Inhibidor de ARNasa, murino (NEB #M0314) (opcional) Mezcla de solución de ribonucleótidos (NEB #N0466) DTT fresco (opcional) Agua libre de nucleasas (NEB #B1500) Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 1 nmol de ATP en material insoluble en ácido en un volumen de reacción total de 50 μl en 1 hora a 37 °C. Condiciones de reacción Tampón de reacción 1X RNAPol Incubar a 37 °C Tampón de reacción 1X 40 mM Tris-HCl 6 mM MgCl2 1 mM DTT 2 mM espermidina (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 50 mM Tris-HCl 100 mM NaCl 20 mM β-ME 1 mM EDTA 50 % Glicerol 0,1 % (p/v) Triton® X-100 pH 7,9 a 25 °C Condiciones del ensayo unitario Tampón de reacción 1X RNAPol, suplementado con 0,5 mM de cada uno de ATP, UTP, GTP, CTP y 1 µg de ADN T7 en 50 μl. Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la secuencia promotora de la ARN polimerasa T7? A: Promotor T7 5' TAATACGACTCACTATAG 3' La ARN polimerasa T7 inicia la transcripción en la G subrayada de la secuencia promotora. Luego, la polimerasa transcribe usando la hebra opuesta como molde de 5'->3'. La primera base de la transcripción será una G. P: ¿Es posible iniciar la transcripción con una A? R: La ARN polimerasa T7 puede iniciar la transcripción con una A bajo el promotor T7 de clase II. De forma similar al promotor T7 normal, se prefiere la G en la 2.ª y 3.ª posición. Promotor T7 clase II 5'- TAATACGACTCACTATTA 3' P: ¿Requiere un cebador la reacción de transcripción con la ARN polimerasa T7? R: No, la ARN polimerasa T7 reconoce su secuencia promotora específica e inicia la transcripción en la G final. Luego, la polimerasa transcribe usando la hebra opuesta como molde de 5'->3'. P: ¿La ARN polimerasa T7 deja una base extra al final de una transcripción? R: Sí, la ARN polimerasa T7 puede añadir una o varias bases extra al final de una transcripción, produciendo un conjunto de transcripciones con extremos 3' heterogéneos. P: ¿Funcionará la ARN polimerasa T7 en sustrato monocatenario? R: No, la región de la secuencia promotora debe ser bicatenaria. P: ¿Funcionará la ARN polimerasa T7 en ADN plasmídico sin cortar? R: Sí, pero la ARN polimerasa T7 es una enzima extremadamente procesiva y continuará transcribiendo alrededor de una plantilla circular varias veces sin disociarse. El plásmido se puede linealizar con una enzima de restricción que deja un saliente romo o 5' aguas abajo del ADN de interés. P: ¿Se puede producir ARN aberrante al usar la ARN polimerasa T7? R: Se ha observado ARN aberrante cuando la enzima de restricción utilizada para linealizar el plásmido aguas abajo del ADN de interés produce un saliente 3'. Para evitar esto, el plásmido debe cortarse con una enzima de restricción que deje un saliente romo o 5' aguas abajo del ADN de interés. P: ¿Puedo usar la ARN polimerasa T7 para crear sondas radiomarcadas de alta actividad específica? R: Sí, se pueden usar la ARN polimerasa T7, la ARN polimerasa SP6, la ARN polimerasa T3 y el kit HiScribe T7 (NEB n.° E2040) para crear sondas de ARN. Se puede obtener una mayor sensibilidad de detección de ácidos nucleicos usando una sonda de ARN debido a la mayor estabilidad de los híbridos ARN/ADN que los híbridos ADN/ADN. P: ¿Cuáles son las principales causas de fallo de reacción usando la ARN polimerasa T7? R: La ARN polimerasa T7 es extremadamente sensible a la inhibición por sal. La concentración de sal monovalente no debe superar los 20 mM. El molde de ADN debe prepararse sin sal. La contaminación por ARNasa degradó el producto de ARN. Recomendamos usar inhibidor de RNasa (NEB #0314 o #M0307) en la reacción a 1 unidad/ul. Use agua ultrapura y asegúrese de que el molde de ADN haya sido extraído con fenol/cloroformo. P: ¿Por qué es baja la actividad específica de la sonda? R: La concentración del nucleótido radiactivo debe ser limitante (6 μM). En otras palabras, si se usa ATP marcado, agregue 500 μM de UTP, CTP y GTP, pero solo 6 μM de ATP en la transcripción para que el ATP se incorpore en un porcentaje mayor, lo que resulta en una sonda de ARN muy caliente. P: ¿Cómo se puede maximizar el rendimiento de ARN cuando se usa la ARN polimerasa T7? R: Se pueden obtener mayores rendimientos de ARN elevando las concentraciones de NTP, la cantidad de molde de ADN y la cantidad de ARN polimerasa T7. Los kits HiScribe T7 de NEB han sido optimizados para sintetizar ARN sin modificar de alto rendimiento y ARNm con capuchón y cola. Consulte las páginas del producto para obtener más información. E2040: Kit de síntesis de ARN de alto rendimiento HiScribe® T7 E2050: Kit de síntesis de ARN de alto rendimiento rápido HiScribe® T7 E2060: Kit de ARNm HiScribe® T7 ARCA (con cola) E2065: Kit de ARNm HiScribe® T7 ARCA E2080: Kit de ARNm HiScribe® T7 con reactivo CleanCap® AG